2016 Fiscal Year Annual Research Report
ヌクレオチド除去修復におけるゲノムDNA損傷認識の高次制御機構の解明
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16H06307
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
菅澤 薫 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 教授 (70202124)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩井 成憲 大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (10168544)
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| Project Period (FY) |
2016-05-31 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / 蛋白質 / DNA損傷認識 / ヌクレオチド除去修復 / 色素性乾皮症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NERのDNA損傷認識因子XPCにHA-FLAGタグを融合したものを安定発現するHeLa細胞株の抽出液から単離・精製した複合体について質量分析を行い、ヒストン修飾やクロマチン・リモデリングに関わる複数の因子を同定した。修飾ペプチドアレイを用いた解析から、XPCがある種のメチル化ヒストンと特に強く相互作用する可能性が見出されていたが、大変興味深いことに、上記の相互作用因子の中に関連するヒストンメチル化酵素が含まれていることがわかった。この酵素を発現抑制した時の細胞の紫外線感受性やDNA修復速度、局所紫外線照射部位へのXPCの集積速度に対する影響を解析している。また、もう一つのDNA損傷認識因子DDB2と相互作用することが見出された解糖系酵素PKM2を安定的に発現抑制したHeLa細胞株を作製したところ、紫外線感受性の増強及びDNA修復速度が低下する傾向が見られた。昆虫細胞を用いてPKM2の組換えタンパク質の発現・精製を行うとともに、種々の変異体を作製してPKM2がもつピルビン酸キナーゼ、プロテインキナーゼの活性と紫外線応答との関係を解析している。
局所紫外線照射に伴うDNA損傷認識因子の集積に影響を与える因子のスクリーニングのため、波長780 nmのパルスレーザーを用いた三光子吸収と共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡を組み合わせたライブイメージング系を構築した。この系を用いて、EGFPを融合したXPCが期待通り局所紫外線照射部位に集積すること、DDB2の発現抑制によってXPCの集積が遅延することが確認された。また、クロマチン構造をとった損傷DNAを基質とする無細胞NER反応系に用いるため、ヌクレオソーム・ポジショニング配列を11コピー含むDNAコンストラクトを作製し、ヌクレオソーム再構成の方法と効率を検討した。さらに、クロマチン上のDNA損傷認識の詳細な分子機構の理解に向け、損傷DNAを含むヌクレオソームのX線結晶構造解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画のうち、DNA損傷認識因子と相互作用する新規因子の同定に関しては、XPCと多数のクロマチン構造関連因子の相互作用が見出されるなど、順調に成果が得られている。特にヒストンメチル化酵素については、XPCとある種のメチル化ヒストンとの特異的な相互作用が見出されたことから、NERの制御に関わる新たな因子の候補として非常に有望であると期待される。クロマチン基質を用いた無細胞NER反応系の再構成も概ね順調に進んでいる。
一方、多光子吸収を用いた局所紫外線照射とライブイメージング系の導入に関しては、研究計画の実施に必要なレーザーパワーの算出等の予備実験を実施できる研究施設がきわめて限られること、実際に確定した仕様に沿ったフェムト秒レーザーの調達にも予想以上に時間がかかったことから、スクリーニングの開始が3か月程度遅れることになった（これにより、当該システムのリース料等、一部の研究経費の次年度への繰越を行った）。最終的には期待通りにDNA損傷認識因子の局所紫外線照射部位への集積や、ポジティブ・コントロールとしてのDDB2発現抑制の影響が確認できており、基本的な系の構築は完了したと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA損傷認識因子と相互作用する因子の解析に関しては、引き続きXPCやDDB2複合体の構成成分の同定を進める。得られた因子について発現抑制や過剰発現を行い、細胞の紫外線感受性やDNA修復速度、損傷認識因子の局所紫外線照射部位への集積速度に対する影響を調べるとともに、それ自身が損傷部位に集積するかどうかを検討する。特にXPCと相互作用する因子として新たに見出されたヒストンメチル化酵素、DDB2と相互作用する解糖系酵素については重点的に解析を進める。
多光子吸収を用いた局所紫外線照射によるイメージング・スクリーニングについては、基本的な系の構築が完了したので、次年度以降、siRNA及び化合物ライブラリーの本格的なスクリーニングを開始する。まずはクロマチン関連因子を標的とするsiRNAライブラリーなど、ある程度対象の数を絞ってスクリーニング効率等の基本的な検討を実施する。無細胞NER反応系を用いた生化学的解析については、ヌクレオソームを再構成した損傷DNA基質を用いた反応系を構築し、相互作用因子の同定やライブイメージング・スクリーニングにより得られる因子の機能解析に備える。
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