2017 Fiscal Year Annual Research Report
ヌクレオチド除去修復におけるゲノムDNA損傷認識の高次制御機構の解明
| Project/Area Number |
16H06307
|
|---|
| Research Institution | Kobe University |
|---|
Principal Investigator |
菅澤 薫 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 教授 (70202124)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩井 成憲 大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (10168544)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-05-31 – 2021-03-31
|
| Keywords | 遺伝子 / 蛋白質 / DNA損傷認識 / ヌクレオチド除去修復 / 色素性乾皮症 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までにXPCと相互作用する因子として同定したヒストンメチル化酵素についてsiRNAによる発現抑制を行い、局所紫外線照射部位へのXPCのリクルート及びDNA損傷の修復がともに遅延することを明らかにした。またこの酵素に蛍光タンパク質を融合したものを細胞で発現し、それ自身が局所紫外線照射部位に集積することを見出した。一方、塩基除去修復とエピゲノム制御に関与し、XPCと相互作用するチミンDNAグリコシラーゼ（TDG）の人為的な発現制御が、その酵素活性非依存的に大規模な遺伝子発現変動を引き起こすとともに、細胞の紫外線応答を制御することを示した。
三光子吸収と共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡を組み合わせたライブイメージング系を用いて、XPCの局所紫外線照射部位への集積に影響を与えるsiRNA及び化合物の探索のための検討を行った。蛍光タンパク質を融合したXPCの発現レベルが細胞によって異なると結果の評価が困難になるため、CRISPR/Cas9により蛍光タンパク質mCherryを内在性XPCのC末端に融合した細胞株を作製した。これを用いて、クロマチン関連因子を標的とするsiRNAライブラリーのスクリーニングを開始し、XPCの損傷部位へのリクルートを遅延させる候補因子を既に複数見出した。
損傷DNA基質を含むクロマチン基質の作製について検討を行い、ヌクレオソーム・ポジショニング配列を複数コピー含むDNAコンストラクトを制限酵素で直鎖状にした上で、塩透析法による再構成を行うこととした。一方、シクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）を含む裸の損傷DNA基質を直鎖状にした場合、損傷の5'側に比較的長いDNA領域が存在しないと修復効率が著しく低下することを見出した。同じ紫外線誘発損傷でも（6-4）光産物の場合は5'側のDNA領域の影響はより軽微であり、損傷の種類によって異なる認識機構が働いている可能性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNA損傷認識因子の相互作用解析に関しては、XPCと相互作用するヒストンメチル化酵素の発現抑制が、XPCによる損傷認識過程やNER反応に実際に負の影響を与えることが示されたほか、このメチル化酵素自身が紫外線損傷部位にリクルートされることが明らかになったことで、新たなNER制御因子である可能性がきわめて高いと期待される。また、TDGはNERの分子機構に直接影響を与えるものではなかったが、遺伝子発現制御を介して細胞の紫外線感受性やNER活性に影響を与えうることが示されるなど、当初の想定とは異なる興味深い知見も得られつつある。
一方、多光子吸収を用いた局所紫外線照射とライブイメージングを用いたスクリーニングに関しては、昨年度は系の導入に予想外に長時間を要した。その後の検討により、スクリーニングに適切な細胞株の作製を行うとともに、クロマチン関連因子を標的とするsiRNAライブラリーのスクリーニングが順調に稼働し、既に複数の候補因子を取得している。上記の相互作用因子の機能検証にもこの系を使用しており、全体として実験系の有機的な連携が図られつつある。無細胞NER反応系を用いた生化学的解析では、損傷DNAのクロマチン構造形成の影響を検討する過程で、紫外線誘発DNA損傷認識の分子機構に関する予想外の新たな知見が得られた。以上のことから、全体として研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
DNA損傷認識因子と相互作用する因子の解析に関しては、引き続きXPCやDDB2複合体の構成成分の同定を進める。得られた因子について発現抑制や過剰発現を行い、細胞の紫外線感受性やDNA修復速度、損傷認識因子の局所紫外線照射部位への集積速度に対する影響を調べるとともに、それ自身が損傷部位に集積するかどうかを検討する。特にXPCと相互作用するヒストンメチル化酵素がきわめて有望な候補因子であることから、XPCとの相互作用やNERにおける機能について重点的に解析を進める。
多光子吸収を用いた局所紫外線照射によるイメージング・スクリーニングについては、まずはクロマチン関連因子（約500種類）を標的とするsiRNAライブラリーのスクリーニングに注力する。得られた候補因子については、二次スクリーニングとしてsiRNAによる発現抑制が細胞の紫外線感受性やDNA修復速度に及ぼす影響を解析し、実際にNERの制御に関わっているものを選別する。化合物ライブラリーについては、まずは化合物アレイを用いてXPCやDDB2と相互作用するものを取得して、それらについて効果を調べることを計画している。
無細胞NER反応系を用いた生化学的解析については、引き続きヌクレオソームを再構成した損傷DNA基質を用いたNER反応系の検討を進め、クロマチン構造を取ったDNA基質特異的に要求される因子の探索に供する。
|
