2018 Fiscal Year Annual Research Report
関節軟骨の生体恒常性の維持および破綻機構の統合的理解に基づく革新的医療技術の開発
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16H06393
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
西村 理行 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (60294112)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
波多 賢二 大阪大学, 歯学研究科, 准教授 (80444496)
村上 智彦 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (50510723)
高畑 佳史 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (60635845)
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| Project Period (FY) |
2016-05-31 – 2021-03-31
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| Keywords | 関節軟骨 / 変形性関節症 / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．すでに同定したPrg4遺伝子の発現を上昇させる転写因子のノックアウトマウスをin situ hybridization法にて解析すると、Prg4の発現の低下が観察された。また関節軟骨特異的ノックアウトマウスでも、Prg4の発現が低下することをRT-qPCRにて確認した。
２．Prg4遺伝子に結合する分子を探索すると、Prg4遺伝子の発現を低下させるリプレッサーを同定した。このリプレッサーが上記の転写因子と結合することを、免疫共沈降法にて確認できた。またこのリプレッサーの遺伝子を欠失するノックアウトマウスをCas9ゲノム編集法にて作製したところ、そのホモ欠失マウスは著明な骨格形成不全を呈していた。
３．関節軟骨の恒常性の維持機構を明らかにするために、関節軟骨表層細胞特異的サイトカインであるGDF5遺伝子座に蛍光タンパク質ZsGreenを挿入したノックインマウスを作製した。このGDF5-ZsGreenノックインマウスは、歩行異常などの変形性関節症様症状を呈した。またGDF5と同じBMPファミリーに属するBMP2との作用をMicroarray解析にて検索したところ、GDF5とBMP2は、ほぼ同様の遺伝子の発現を増加させることが判明した。したがって、GDF5はBMP2と同様の作用を有している可能性が推測された。
４．SFZ細胞と成長軟骨細胞の特性の違いを明らかにするために、成長軟骨細胞の代表的マーカーである2型コラーゲン(Col2a1）遺伝子の発現を関節軟骨にて検索した。マウス関節軟骨組織をin situ hybridization(ISH)法にて解析した結果、関節軟骨の一層に存在するSFZ細胞は、Prg4を発現し、2型コラーゲン遺伝子（Col2a1）を全く発現しないことを明らかにした。したがって、Prg4とCol2a1は、SFZ細胞あるいは成長軟骨細胞各々に特異的である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．Prg4遺伝子を制御する転写因子とそのリプレッサーを同定し、両者の作用機序を分子、細胞およびin vivoで明らかにした。
２．前年度までに変形性関節症の発症に関与する転写因子として同定したSox4およびSox11の機能解析を完了して、論文公表した。
３．関節軟骨細胞の新規のマーカー遺伝子の候補群ならびに変形性関節症の早期マーカーとしてPrg4タンパク質の分解産物を同定した。
４．Prg4遺伝子に発光タグHiBiTを挿入したノックインマウスを作製し、変形性関節症に対する新規治療薬を探索するできるハイスループットスクリーニングシステムを構築できた。
以上の事由を総合的に考慮し、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．GDF5遺伝子を発現制御に関わる転写因子を同定するために、enChIP法による遺伝子クローニングを実施する。同定された転写因子のin vitroでの検索は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、ChIP解析、およびRT-qPCR法による発現解析にて実施する。in vivoでの解析を行うために、Cas9ゲノム編集法にて当該遺伝子のノックアウトマウスを作製する。
２．変形性関節症の治療薬を探索するために、関節軟骨の機能に重要なプロテオグリカンであるPrg4の発現を増加させる低分子化合物の探索を行う。Prg4-HiBiTノックインマウスから関節軟骨表層（SFZ）細胞を分離、培養して、低分子化合物ライブラリーを作用させ、HiBiTルシフェラーゼの活性を指標にスクリーニングを実施する。得られたリードコンパウンドの作用は、in vitroで解析を進めるとともに、Prg4-HiBiTノックインマウスに投与して、in vivoでの検索を行う。in vivoでの検索は、発光イメージングによりライブイメージングを実施する。
３．SFZ細胞の恒常性の維持に関わるGDF5の役割を明らかにする。すでに作製できたGDF5-ZsGreenノックインマウスを交配して、GDF5ノックアウトマウスを作出し、そのマウスよりSFZ細胞を採取する。同腹の野生型マウス由来のSFZ細胞、GDF5ノックアウトマウス由来のSFZ細胞、その細胞にGDF5あるいはBMP2を作用させた細胞からRNAを抽出し、RNA-SeqあるいはMicroarray解析にてそれぞれの遺伝子発現プロファイルを検索する。その結果に基づいて、SFZ細胞におけるGDF5の標的遺伝子を明らかにする。
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