単一細胞の機械的特性評価と遺伝子発現の相関解析用バイオMEMSの基盤構築

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K04914
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 久米村 百子 東京大学, 生産技術研究所, 助教 (50533642)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金田 祥平 東京大学, 生産技術研究所, 助教 (10542467)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: MEMSピンセット / 単一細胞 / 機械特性計測 / 単一細胞遺伝子発現解析

Outline of Annual Research Achievements

細胞の硬さ、粘弾性や変形能などの機械特性は、近年改めて注目を集めている。例えば、がんの転移を引き起こすとされている血中循環腫瘍細胞は、組織から血管へ変形しながら浸潤する。遺伝子解析技術の発展により、細胞機械特性に関連するアクチンなどの遺伝子が特定されつつあるものの、細胞機械特性と遺伝子発現の状態について両者を同時に取得することはできなかった、そこで本研究では、細胞の機械特性と関連遺伝子の発現状態を対応付け可能とする手法を開発する。具体的には、マイクロマシニングにより作製したMEMSピンセットを用いて単一細胞の機械特性を計測したのち、細胞をハンドリングし、遺伝子発現解析系へと接続する。本研究の達成によって、既存技術では困難であった細胞の力学特性と遺伝子情報の一対一の相関が議論可能となり、がん転移能と細胞機械特性の関連性解明に貢献する。
具体的な個別課題は、以下の通りである。(1) 顕微鏡画像を用いてシャーレ内の任意の細胞をMEMSピンセットで把持し、他の場所へ搬送する実験セットアップを構築する。(2) 細胞機械特性（例：細胞サイズ，硬さ，粘弾性係数）の測定を行う。MEMSピンセットと液体界面の位置決めと測定条件、適切な測定項目を把握し、再現性のある測定系を確立する。並行して、(3)単一細胞の遺伝子発現解析の条件を最適化する。(4) 以上の操作をCTCモデル細胞へ適用する。モデルCTCの機械特性と遺伝子発現状態の関係を調べ、がん悪性度を評価するために最適な細胞機械特性の選定と、判定基準を見いだすことを目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度は、(1) 溶液内の細胞をMEMSピンセットにより把持する方法（課題1）、(2) 実際の細胞把持・機械特性計測（課題2）、(3) 把持・計測した単一細胞を遺伝子発現解析のフローへ繋ぐ方法（課題3）、(4) MEMSピンセットが遺伝子発現解析反応に与える影響（課題3）について検討した。(1)について、細胞を把持するセットアップは、当初予定していた垂直方向からMEMSピンセットをアプローチする方法ではなく、水平方向から挿入するセットアップとした。細胞はリン酸緩衝生理食塩水（PBS溶液）にけん濁させており、市販のシャーレに入れた場合、アプローチ中に、PBS溶液がMEMSピンセットの電極部分に付着する恐れがある。そこで、シリコーンゴムを２枚のカバーガラスで挟みこんで、MEMMSピンセットのプローブを水平方向から挿入できるマイクロチャンバを作製し、細胞の充填・保持に使用した。マイクロチャンバは電動XYZステージに固定し、Labviewソフトウエアにより位置決め制御し、MEMSピンセットのプローブを水平方向から挿入・細胞捕獲した。(2) 上記の実験セットアップを使って、前立腺がんセルラインであるPC-3細胞を把持し、MEMSピンセットのプローブ間隔を変えることによって、細胞を圧縮した。急激にプローブ間隔を変えるステップ応答計測を行い、細胞に力を加えるほど、細胞が硬くなる結果を得た。(3) 計測後の細胞は、MEMSピンセットで把持したまま、ヒーター上で加熱した細胞溶解液に浸して、細胞内構成物を液中に溶解させた。細胞溶解液ごとマイクロピペットで回収することで、遺伝子発現解析のサンプルとできる。(4) 遺伝子発現解析で行う３つの反応（細胞溶解反応，逆転写反応，ポリメラーゼ連鎖反応）を、MEMSピンセットが阻害していないかを実験し、影響を与えないことを確認した。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度は、研究計画の課題2, 課題3 の中で、前年度に達成できなかったものを、集中的に実施する。課題2：細胞の機械特性測定方法の確立については、計測において、ステップ応答、静荷重応答、周波数応答測定を試みる。また、昨年度行った実験の中で、捕獲・計測した細胞を、プローブから離すことは容易ではないと分かった。この問題を解決するために、プローブ表面をはっ水性にして、細胞を離しやすくするなどの表面改善を行う。課題3：MEMSピンセットにより搬送した単一細胞の遺伝子発現解析条件の探索については、実際に機械特性計測後の細胞に対して、遺伝子発現解析を行い、データを取得していく。研究の進捗に応じて、複数種類の細胞を実験に応用する予定である。

Research Products

• [Presentation] A PRACTICAL SINGLE CELL ANALYSIS METHOD FOR MECHANICAL CHARACTERIZATION OF CANCER CELLS (2017)
  • Author(s): T. Baetens, G. Perret, Y. Takayama, M. Kumemura, L. Jalabert, S. Meignan, C. Lagadec, H. Fujita, D. Collard, M. C. Tarhan
  • Organizer: IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS2017)
  • Place of Presentation: Las Vegas, NV, USA
  • Year and Date: 2017-01-22 – 2017-01-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Trapping of a cell and it's mechanical characterization by silicon nanotweezers (2016)
  • Author(s): M. C. Tarhan, M. Kumemura, S. Kaneda, Y. Takayama, G. Perret, T. Fujii, D. Collard, H. Fujita
  • Organizer: International Conference on Single Cell Research 2016
  • Place of Presentation: Ito International Research Center, The University of Tokyo, Tokyo, Japan
  • Year and Date: 2016-11-16 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research