2016 Fiscal Year Research-status Report
小型魚類ALSモデルを用いたTDP-43毒性の理解と制御
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16K07045
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
浅川 和秀 国立遺伝学研究所, 個体遺伝研究系, 助教 (30515664)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | TDP-43 / ALS / PI3キナーゼ / 脊髄運動ニューロン / カルシウムイメージング / CaP / フローサイトメトリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ヘテロリボ核タンパク質TDP-43のタンパク質恒常性の崩壊によって誘発される脊髄運動ニューロンの機能障害のメカニズムを解析する為のゼブラフィッシュ筋萎縮性側索硬化症（ALS）モデルを構築し、ALSにおける運動ニューロン変性の分子基盤の理解を深めることを目指している。さらに、脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43毒性が、PI3キナーゼの活性化によって緩和される、という独自に見出した現象のメカニズムを解明し、PI3キナーゼ経路の機能修飾という視点から、ALS 治療戦略の構築の可能性を検討することを目指している。
H28年度は、ゼブラフィッシュにおいて脊髄節あたりに一つ存在する脊髄運動ニューロンサブタイプCaPにおいて、Gal4依存的に活性化型PI3キナーゼ（zp110*）とカルシウムプローブGCaMPを、共に発現するトランスジェニック系統Tg[prdm14-GAL4, zp110*-UAS-GCaMP]系統を作製した。さらに、同様の条件下でCaP細胞にTDP-43を過剰発現するTg[prdm14-GAL4, UAS-TDP-43, zp110*-UAS-GCaMP]系統を作製した。二光子励起顕微鏡によるCaPのカルシウムイメージング法を用いて、CaPの神経興奮性の比較を行ない、PI3キナーゼの活性化がTDP-43過剰発現による神経興奮性の低下を緩和することを確認した。また、脊髄運動ニューロンのトランスクリプトーム解析の前段階として、ほぼ全ての脊髄運動ニューロンがEGFPでラベルされ、なおかつ、TDP-43を過剰発現するTg[mnr2b-Gal4, UAS-EGFP, UAS-TDP-43-RFP]稚魚を構築し、フローサイトメトリーを用いて、GFP・RFP陽性の細胞として、TDP-43RFPを過剰発現する脊髄運動ニューロンを分離するための条件検討をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
３カ年の計画において、初年度に予定していた研究計画をおおむね達成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、PI3キナーゼの活性化が、TDP-43毒性による神経筋シナプスの形成阻害を回復させるか検討する。この実験に必要なトランスジェニックフィッシュは作成に成功しつつある。TDP-43毒性の緩和効果を説明するPI3キナーゼの下流因子の探索が重要であるが、緩和効果の細胞・分子基盤の全体像をつかむため、H28年の準備を踏まえてRNA-seqを用いたトランスクリプトーム解析を実施する。また、PI3キナーゼの緩和効果を、mTORキナーゼの阻害剤、ラパマイシンが部分的に抑圧するという予備的な結果を得ていることから、CaPの軸索伸長や神経活動におけるラパマイシンの効果を検証したい。
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