2016 Fiscal Year Research-status Report
神経発達に伴う細胞サイズ制御機構の解明と病態モデルの確立
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16K07053
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
武井 延之 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | mTOR / 細胞サイズ / 神経発達 / neural stem cell / 脳形成異常 / シグナル伝達 / 蛋白合成 / 神経栄養因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
実績の概要を研究計画のサブテーマごとに記載する。
①神経幹細胞と神経細胞におけるm TO R シグナルの違いとそれを誘起する因子を解明する。１）シグナルの違い：ラットからneurosphere を調整し、定法に従って維持及び分化誘導を行なった。神経幹細胞(neurosphere状態)、神経前駆細胞（単層培養）、分化誘導神経細胞と初代培養神経細胞を各種マーカー蛋白の発現で同定した後、それぞれのmTORシグナル系の活性化状態を調べた。mTOR のキナーゼ活性測定、およびリン酸化特異抗体を用いた基質(p70S6K と4EBP)のリン酸化レベルの変動を明らかにした（結果に関しては未発表の為、非公表）。さらに分化状態によってS6Kのp70とp85の比率が変化することも見いだした。このことの生理的意義は不明だが、S6Kの活性測定を計画している。2) 細胞外因子の作用：基質接着因子（ラミニンなど）によってmTOR活性が変化することを見いだしたが、詳細については現在検討中である。3) 細胞サイズの比較：細胞の発達の各段階でそれぞれのマーカーの抗体と、細胞膜染色試薬の二重染色像を行って、画像を取得していおり、順次３次元再構成をおこなってデータを解析している。Sphere形成時の細胞に比較して分化後では数倍～１０倍の細胞容量の増大が確認されている。
②ゲノム編集：ゲノム編集に関しては、神経幹細胞への遺伝子導入効率の悪さもあって難航している。並行してエレクトロポレーションによる通常のmTOR活性型変異体の過剰発現を行い、一過性の発現に関しては（効率は悪いが）安定している。しかし一過性発現では細胞サイズの変動にまで至らないことが多く、現在株化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度の研究はおおむね当初の計画通りに進展している。ゲノム編集に関しては当初の危惧通り難航しているが、代替策としてのmTOR活性型変異体の過剰発現によって細胞サイズ途の関連や分化との関連は解明できると考えられる。しかしながら病態モデルとしてはゲノム編集が望ましいので、引き続き専門家の助言をもらいながら試行し、成功させたい。
その他、mTORシグナルに関して末梢組織や癌細胞、さらには冬眠動物脳における知見が得られたのは、新たな研究の展開につながるseedsといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
H29年度の計画としていた蛋白合成、脂質合成と細胞サイズの変化については、H28年度中に予備的な結果が得られた。分化段階に応じた蛋白合成、脂質合成について追試を行い、定量データを集め、確定させる予定である。また病態モデルとしては、以下の２つを行う。
１）子宮内エレクトロポレーション法により、mTOR活性型変異を胎仔に発現させ、細胞の形態、サイズを解析する。
２）mTOR活性型変異体を安定発現した神経幹／前駆細胞を胎仔（新生仔）の脳内に移植し、in vivoでの成長／変化を解析する。
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| Causes of Carryover |
今年度の実験が主に培養系であり、物品（培養用器具、抗体、試薬等）が予想より節約できた。新たな種類の実験に必要なものは次年度に購入予定なので、繰り越した。限られた資金を節約して有効に使用できたと考えている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たな実験の為、29年度は物品費が増加する見込みであり、主に試薬、キット等の消耗品に充当する予定である。
また29年度には論文発表を予定しており、英文校正費、投稿料などに使用予定である。
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