高感度域でも良好な定量性を示し、普及し易いメチル化DNA解析法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07153
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 野村 幸男 公益財団法人がん研究会, 有明病院 TR支援部, 臨床研究支援専門職員 (70714773)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 新井 正美 公益財団法人がん研究会, 有明病院 遺伝子診療部, 部長 (20232027) ; 石塚 直樹 公益財団法人がん研究会, 有明病院 臨床試験部, 副部長 (50392395)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: メチル化DNA / リアルタイムPCR / 融解曲線解析 / 高感度定量 / 超高感度定量 / HyperMethylation / HypoMethylation / 腫瘍DNAパネル

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、リキッドバイオプシに使用しうる高感度・定量的でかつ、汎用性のあるメチル化DNA解析法を開発することにある。 MSI陽性大腸がんにおいて高頻度に観察されるMLH1遺伝子プロモーターのHyper Methylation解析をモデル系として解析手法の開発中にある。本法は世界中で使用されているリアルタイムPCR機器を用いた解析が可能であり、0.1％以下の超高感度が狙える上定量性があり、既存の手法に比べて簡便安価な手法となるため、広範な普及が期待される。
申請時に提示した図の一つは、MLH1プロモーターCpGアイランドのメチル化DNAの解析であり、メチル化DNA用と非メチル化DNA用プライマーの混在プライマーにより通常の融解曲線解析による通常域（5%~100%)の定量性と、高感度化条件での（＜5％）の定量性を示した。その際、メチル化DNA領域の高感度解析は可能であったが、非メチル化DNA領域の高感度解析については、メチル化DNA領域ピーク由来ピークが非メチル化DNAピークに高度に重複し、困難であった。
その後採択された科研費にて購入した試薬を使用した工夫により、0.1%以下の超高感度域での定量性が視野に入った上、非メチル化DNAについてもメチル化DNAと同程度の高感度解析が可能となった。ただしこの程度まで高感度になると、通常では問題にならない問題がクローズアップしたが、進捗状況に述べる工夫でクリアした。
そこでこの技術の臨床応用に向けて、がん特異的高メチル化領域と低メチル化領域のターゲット選定を行っている。ターゲット遺伝子はパネル化して検査化するできるよう複数のがん特異的マーカーとしてアッセイ系の構築を行い、パラフィン包埋検体とリキッドバイオプシ検体を用いた臨床研究により、選定したターゲットのがん特異的DNA検出への有効性と、本法の臨床応用への可能性を検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

メチル化DNAと非メチル化DNAの融解曲線解析において、ピーク分離が十分可能な解析手法が、高感度定量に重要であるが、この条件検討と問題解消に労力の多くを費やしており、市販血漿を用いた検討まで行えていない。ただし新たなアイデアによって上記ピーク分離をもたらし高感度定量が行えるようになり、MLH1とBRCA1遺伝子以外のターゲットの選定とアッセイ系の作成を進めている。
超高感度域定量用スタンダードオリゴ製造時には、メーカー内でのクロスコンタミが無視できない現象として観察されたが、メチル化DNAと非メチル化DNAの定量用オリゴのメーカーを分けることで当該問題の大部分がクリアされることを確認した。
臨床研究向きのターゲットのPCR プライマー設計には、TCGAで蓄積されているInfinity ビーズアレイデータと共にWhole Genome Bisulfite Sequencingによる高密度なデータが本法には特に有用と考えており、双方のデータを一度に比較できるUCSC Genome Browserによりプライマー設計部位を精査し、選定している。ただし、プライマーサイトが制限されるため高性能なPCRプライマーの設計には困難があり、PCRの成功率が通常のPCRに比べて低いことが想定された。
そこでPCR プライマーの有効性を評価するアッセイ系を作成し、そこでメチル化DNA特異的検出と非メチル化DNA特異的な検出が可能なプライマーセットを次の腫瘍パネルDNAによる腫瘍特異的検出能の評価工程へすすめることにした。前者のアッセイ系には、市販コントロールDNAを、後者の評価工程には市販の腫瘍DNAパネルをバイサルファイト処理したDNAをパネル化して使用している。双方とも、チューブ底に処理済DNAを分注乾固させたストライプチューブを大量作成し、高効率にターゲット選定できるシステムを整えた。

Strategy for Future Research Activity

今後は。大腸がんや乳がん等に対する特異的DNAメチル化領域、非メチル化領域の候補選定を行い、作成した評価システムにて臨床研究に使用するターゲットを確定する。　それらの腫瘍特異的なターゲットのアッセイ系を複数作成し、パネル化した上で臨床研究をすすめる。臨床研究前には市販血漿を用いた検討を行い、具体的な検査系を構築しておく。市販血漿にメチル化DNAを想定したオリゴDNAや市販コントロールDNAを濃度段階的にスパイクした材料を仮想臨床検体として用い、バイサルファイト処理と高感度定量解析を行い、問題点の洗い出しと解消を事前に行っておく。臨床研究では、パラフィン包埋材料にて後ろ向き検討を行い、選定したターゲットの有用性を確認する。その後もしくは平行してリキッドバイオプシ材料について選定ターゲットの解析を行い、将来の大規模前向き解析に向けた本法の有用性を確認する。

Causes of Carryover

報告書に述べた想定外の問題発生とその解消に手間取り、想定していた仮想臨床検体を使用した検査の実施と、ターゲット選定－アッセイ系構築が遅れており、試薬費用の支出が想定より少なかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

問題は解消されており、ターゲット選定とアッセイ系構築を進め、前期に予定していた市販血漿を用いた検討を実行する。