2016 Fiscal Year Research-status Report

複製ストレスチェックポイント制御に関わるRBファミリーの新規分子機能

Research Project

Project/Area Number	16K07250
Research Institution	Hamamatsu University School of Medicine
Principal Investigator	内田千晴浜松医科大学, 先進機器共用推進部, 准教授 (60223567)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	DNA複製ストレス / 細胞周期 / RBファミリー
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、「DNA複製ストレスチェックポイント制御に関わるRBファミリーの新規分子機能」の解明を目指している。申請者らは、準備研究期間で得たp130RB2とDNA複製ストレス応答因子の相互作用等の結果から、「p130RB2はDNA複製ストレス応答に関与し、ゲノム恒常性の維持に機能する」と考え、これを検証し、RBファミリー(p130RB2)による複製ストレスチェックポイント制御の分子機構を明らかにすることを目的としている。平成２８年度は、以下の実験結果を得た。 U2OS細胞を2 mM Hydroxyurea処理しDNA複製ストレスを与えた条件において、p130RB2ノックダウンにより、複製ストレス初期と持続期の応答に対して異なる影響がみられた。また、複製ストレスによって活性化されるリン酸化酵素および細胞内因性基質と、p130RB2の細胞内局在を蛍光免疫染色法で調べたところ、複製ストレス応答初期においてp130RB2と共局在する複数のタンパク質が明らかとなった。また免疫沈降実験により、p130RB2と結合する複製ストレス応答因子の候補を新たに見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason p130RB2ノックダウンは、複製ストレス初期と持続期の応答に対して異なる影響を及ぼすこと、p130RB2と結合する複製ストレス応答因子の新規候補を見出したこと等から、研究計画は比較的順調に進んでいるといえる。
Strategy for Future Research Activity	今年度は上記のp130RB2結合能を有する複製ストレス応答因子の翻訳後修飾・細胞内局在の変化、さらにRBファミリーの活性欠損による複製ストレス初期応答の変動を解析する。
Causes of Carryover	計画当初に予想していたp130RB2結合タンパク質に加え、別のタンパク質因子の関与を示唆するデータが得られたため、マウス実験を延期し、培養細胞系での検証を深めることとした。これに伴い実験計画を変更し、予定していた抗体やsiRNAの購入を控えたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度では、新規に予想されるp130RB2結合タンパク質に対する抗体およびsiRNAのロット検討を行い、効果が明らかで再現性のあるものを必要量購入し実験に使用する。 DOX誘導性安定発現、およびノックダウン細胞株の樹立に必要な試薬・培地・器具類を揃える。また、DNA複製ストレスを誘導する種々の薬剤、複製ストレスの検出系の構築に必要な試薬類を購入する。