複製ストレスチェックポイント制御に関わるRBファミリーの新規分子機能

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07250
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 内田 千晴 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 准教授 (60223567)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: DNA複製ストレス / 細胞周期 / RBファミリー

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、「DNA複製ストレスチェックポイント制御に関わるRBファミリーの新規分子機能」の解明を目指している。申請者らは、準備研究期間で得たp130RB2とDNA複製ストレス応答因子の相互作用等の結果から、「p130RB2はDNA複製ストレス応答に関与し、ゲノム恒常性の維持に機能する」と考え、これを検証し、RBファミリー(p130RB2)による複製ストレスチェックポイント制御の分子機構を明らかにすることを目的としている。
平成30年度の実験結果では、U2OS細胞内p130RB2をノックダウンすると、2 mM Hydroxyurea処理によるDNA複製ストレスを与えた条件において、複製ストレス初期に活性化されるべき複数の応答因子のリン酸化レベルが減少、すなわち活性化が抑制されることが、再現性をもって示された。平成29年度では、p130RB2をノックダウンにより活性化が抑制される応答因子の一つについてp130RB2との細胞内共局在および結合を見出していたが、さらに平成30年度にp130RB２結合能を有する別の複製ストレス応答因子を見出した。この因子も複製ストレス応答初期においてp130RB2と共局在することが示された。
また、p130RB2をノックダウンは複製ストレス負荷除去後の１本鎖DNA解消を遅延させた。これまでの我々の実験結果から、p130RB２は複製ストレス応答因子活性化に必要なプラットフォームとしての役割を果たすと推測している。
今年度は新たに見出したp130RB2結合能を有する複製ストレス応答因子の解析を進め、昨年度までの実験結果と合わせ、RBファミリーの活性欠損による複製ストレス初期応答制御メカニズムを明らかにしたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

p130RB2と結合するDNA複製ストレス応答因子の新規候補を見出したこと、p130RB2はDNA複製ストレス応答においてこれらの因子の活性化、さらに複製ストレスからの回復に必要であること等を見出したことから、研究計画は比較的順調に進んでいるといえる。

Strategy for Future Research Activity

今年度は新たに見出したp130RB2結合能を有する複製ストレス応答因子の解析を進め、昨年度までの実験結果と合わせ、RBファミリーの活性欠損による複製ストレス初期応答制御メカニズムを明らかにしたい。
最終年度であるため、複数の異なる実験系から再現性を検証する。

Causes of Carryover

（理由）p130RB2との結合能を有する新たな因子を見出しため、その解析をさらに進める。
（計画）p130RB2と結合することが明らかな複数のタンパク質、DNA複製ストレス応答因子、DNA損傷応答因子の抗体のロットチェックを行い、特異的に検出できる抗体を揃える。蛍光免疫染色に適する抗体、試薬を揃える。新規因子に関するノックアウト細胞株の樹立を進める。これらに必要な試薬、キット類の購入に充てる。