2017 Fiscal Year Research-status Report
クロマチン構造変換因子ARIP4による心筋細胞分化制御機構の解明
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16K07254
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
土屋 惠 大阪大学, 生命機能研究科, 特任助教(常勤) (00390691)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 心筋分化誘導 / 心筋細胞 / クロマチン構造変換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は心筋分化誘導の効率の安定化を図り分化の過程で機能する因子の役割をより明確にすることを目標に、クロマチン構造変換因子ARIP4と核内で協調的に働くと予測される幾つかの心臓主要転写因子（心筋幹細胞分化誘導因子）に着目し、連携研究者の協力のもとでそれらを心筋幹細胞で強制発現できる細胞系の構築を行った。この分化誘導因子群は個々が中胚葉誘導に関与するものの単独では心筋誘導効率を上げるだけでなく他の中胚葉系分化細胞の誘導も促進されてしまい、心筋特異的な分化を促す因子としては不十分であると考えられてきた。しかし我々の構築した細胞系を用いた分化誘導の観察から、特定の転写因子を組み合わせた協調的な働きにより心筋分化を促進するだけでなく他の分化系統を抑制することが明らかになってきた。現在この細胞を用い、分化誘導因子群とARIP4とのクロマチン上での相互作用を明らかにするためChIP解析を行っている。今後さらにChIP-seqによりそれら因子の制御領域を明らかにし、各因子の分化段階におけるクロマチンへの結合時期を明らかにしていく。またこれらと並行しARIP4の核内での機能と細胞分化への関わりを明らかにするために、核内でARIP4との結合が確認されているオートファジーレセプターp62について、その結合のタイミングと核内での局在について検討した。U2OS細胞を用い、p62を核内に移行させた状態で両者の局在を観察したところ、ARIP4はp62と共に核内でdotを形成し、さらに両者は細胞周期依存的に核内で複合体を形成していることが明らかとなった。この結果からARIP4とp62の相互作用が細胞の分化に関与することが示唆され、ARIP4が心筋特異的な分化を促す因子としてクロマチン上で機能することを裏付ける結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度はマウスES細胞（129系統由来EB3 ES cells）を用いて未分化なES細胞よりembryoid bodyを作成し、LIFを除いた分化誘導条件の培地下での心筋への分化を誘導し、拍動開始までの経時的観察を行った。この方法ではES細胞が胚様の集塊を作って増殖・分化するが、その過程では内胚葉・中胚葉・外胚葉すべての細胞系列が誘導され、最終的にはembryoid body内部に心筋細胞を含む様々な細胞が出現する。そのため心筋細胞へ分化する割合は全体の10%程度であり、効率のばらつきも大きいことがこの方法の問題点として残った。またこれまでに作製したARIP4ノックダウンES細胞(ARIP4 KD ES細胞)では内在のARIP4蛋白量レベルが80%程度減少しているが、野生型ES細胞 と比べembryoid bodyの拍動開始までの時間が遅延またはそのまま拍動が見られないものが多く見られ、心筋分化が著しく阻害されていると考えられる。しかしこの実験系においても、心筋分化誘導効率のばらつきが分化の促進や抑制を明確に再現することが困難であった。これらを踏まえ、本年度は心筋分化誘導の効率の安定化を図ることで分化の過程で機能する因子の役割をより明確にしたいと考え、ARIP4と核内で協調的に働くと予測される幾つかの心臓主要転写因子（心筋幹細胞分化誘導因子）に着目し、連携研究者である東京医科歯科大学 竹内 純准教授の協力でそれらを心筋幹細胞で強制発現できる細胞系の構築とその解析を中心に研究を進めた。このように本年度の研究は概ね順調に進んでいるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに我々が作製した心臓特異的ARIP4欠損マウスの表現系と、過去にエネルギー代謝経路の移行の異常として報告されたミトコンドリア因子欠損マウスの表現系が非常に近いことから、ARIP4欠損マウスの心筋でも同様の過程に異常があると予想される。これらを踏まえ、平成30年度は野生型マウスの心臓組織とARIP4欠損マウスの心臓組織から経時的にRNAを抽出し、RNA-seqによって解糖系およびTCA回路系の代謝関連遺伝子の発現変動を調べる。ARIP4欠損マウス心筋ではサルコメア構造の発達が顕著に遅れているため、サルコメア構造関連遺伝子やミトコンドリア融合・分裂関連因子にも注目して代謝経路の移行や心筋分化に関与するARIP4標的遺伝子を絞り込む。さらに絞り込んだARIP4標的遺伝子について、野生型マウス心筋とARIP4欠損マウス心筋とで経時的に定量PCRを行い各遺伝子の変動を比較する。これらと前年度に着目した心筋幹細胞分化誘導因子との発現の時間的推移から、ARIP4を含めた心筋幹細胞分化誘導因子による細胞分化の分子機構の全体像を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当初我々が作製した心臓特異的ARIP4欠損マウスの心臓を用い、組織より抽出したRNAから心筋分化に関与する遺伝子群の発現経時的変化を比較する予定であったが、この実験にはある程度のARIP4欠損マウスが必要とされるため、サンプルの準備にある程度時間がかかることが予想された。そのためマウスES細胞を中心とした細胞分化系と心筋幹細胞の安定的な分化系の構築を先行して行い、昨年度よりES細胞の維持のために研究科が所持しているオープンラボを使用している。RNA-seq、FAIRE-seq等の受託解析及び解析用PC機器等のための経費として計上していた予算の一部をオープンラボ使用料に当てているが、それ以外を最終年度使用分として、計画していた受託解析を行う予定としている。当該助成金が生じた状況としてとして次年度使用分に当たるのはこれらの予算である。
上記理由により、前年度までに計上した受託解析経費の一部が次年度使用額として残されている。受託解析の予算としては減額となっているため、今後の必要な解析を予算内で最大限行えるよう、これまでに予定していたゲノムワイド解析の内容を見直していく。初年度に細胞培養に必要な物品を先行して購入しているため、必要であれば２年目以降に予定していた消耗品予算の一部をゲノムワイド解析に当てることも可能だと考えている。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Ad4BP/SF-1 regulates cholesterol synthesis to boost the production of steroids2018
Author(s)
Baba Takashi , Otake Hiroyuki , Inoue Miki ,Sato Tetsuya , Ishihara Yasuhiro, Moon Ju-Yeon, Tsuchiya Megumi, Miyabayashi Kanako , Ogawa Hidesato, Shima Yuichi , Wang Lixiang , Sato Ryuichiro , Yamazaki Takeshi , Suyama Mikita , Nomura Masatoshi ,Choi Man Ho, Ohkawa Yasuyuki, Morohashi Ken-ichirou
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Journal Title
Communications Biology
Volume: 1
Pages: 18
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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