2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K07267
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
神山 勉 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30170210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 准教授 (90223297)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 陰イオン輸送性ロドプシン / レチナール異性化 / X線結晶構造解析 / 光誘起吸収変化 / バクテリオロドプシン / ハロロドプシン / 低温原子間力顕微鏡 / レチナールタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1)光駆動塩素イオンポンプとして知られるハロロドプシンの反応中間体の結晶構造解析を推し進めてきたが、X線結晶構造解析によりその存在が初めて明らかにされたN’中間体ではレチナール色素が13-cis/15-synの異性化構造をとることが示された。つまり、ハライドイオン輸送サイクル中に3段階のレチナール異性化反応が起こることが示唆された。このような状況にあって、3段階のレチナール異性化反応を支持する実験データを別の観点から収集することを今年度の研究目標に掲げた。まず、ハロロドプシンの光誘起吸収変化を様々な条件下で調べ、得られた実験データを詳細に解析した。その結果、ハライドイオン輸送サイクルの後半部分がハライドイオン濃度に強く依存して変化することがわかった。トランス異性体（HR）の反応サイクルは、ハライドイオンの濃度が低い時には、HR→K→L1→L2→N→N’→O’→O→HRというスキームで記述できるのに対して、高濃度のハライドイオン存在下では、O’から13-シス異性体状態（HR’）への分岐反応が顕著になり、反応サイクルは次のように記述される：HR→K→L1→L2→N→N’→O’→HR’→HR。以上の結果は、ハロゲン輸送サイクル中の3段階のレチナール異性化反応を強く示唆するものである。
2)ハロロドプシン（phR）の結晶形を持つプロトン輸送性ロドプシン（bR）の結晶作製を目指して、タンパク質構造の外部をphRタイプ、機能する内部をbRタイプに置き換えたキメラ遺伝子を設計し、H. salinarumのbop遺伝子と置き換えた。高度好塩性古細菌 H. salinarum MPK409株に形質転換し、薬剤耐性マーカーで導入株の候補を30株選別して、このうち３株のゲノム領域中のbop遺伝子領域が確かにキメラ遺伝子に置き換わっていることを確認した。しかし、発現条件で紫膜状態での発現が観察できていない。これは、bop遺伝子以外の調整遺伝子系が原因で発現しなくなっている可能性が考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者の退職にあたり研究環境が大きく変わったことに加えて、研究代表者の健康面での不安要素も絡まって、研究計画の遂行が少し遅れ気味である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）ハロロドプシンのイオン輸送サイクルの反応中間体の構造解析： N’の構造をより高分解能で決定することを試みるとともに、X線損傷の影響の軽減の測り、N’中間体でのレチナール色素の捻じれ具合を明らかにする。また、13シス異性体（HR’）の捕捉率を高め、その高分解能のX線回折データを収集する。
２）プロトン輸送性ロドプシンのN中間体の構造解析： プロトン輸送性のハロロドプシン変異体を作製し、結晶中の膜タンパク質の充填具合を制御できる技術の確立を目指す。
３）低温原子間力顕微鏡による古細菌型ロドプシンの高次構造の解析： -100度の低温に冷却したエタノール中でイメージングできる低温原子間力顕微鏡の安定した操作を可能にし、凍結した生体膜試料の割断面の形状をナノメールの分解能で解析できるようにする。
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| Causes of Carryover |
購入を検討していた装置（電子顕微鏡の部品）が今年度の使用限度額を超えているため、次年度の予算を加えることで対応するという方針に切り替えた。
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[Journal Article] Salinarchaeum chitinilyticum sp. nov., a chitin-degrading haloarchaeon isolated from commercial salt2017
Author(s)
Minegishi H, Enomoto S, Echigo A, Shimane Y, Kondo Y, Inoma A, Kamekura M, Takai K, Itoh T, Ohkuma M, Ihara K, Takahashi-Ando N, Fukushima Y, Ishii S, Yoshida Y, Usami R
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Journal Title
Int J Syst Evol Microbiol.
Volume: 67
Pages: 2274-2278
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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