2017 Fiscal Year Research-status Report
RhoGEF, Soloと中間径フィラメントを介するメカノシグナル伝達機構の解明
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16K07335
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
大橋 一正 東北大学, 大学院生命科学研究科, 教授 (10312539)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | メカノストレス応答 / アクチン骨格 / RhoGEF / Rho / 中間径フィラメント / 集団移動 / Solo |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは、メカノストレス応答に関与するRhoGEFとして同定したSoloが中間径フィラメントの一つであるケラチン8/18繊維と結合することを見出し、Soloとケラチン8/18繊維との結合の役割を明らかにしてきた。これまでに、MDCK細胞の集団移動においてSoloの発現抑制がその移動速度を加速させることを見出した。本年度は、細胞の集団移動におけるSoloの関連分子の寄与をさらに解析した。ケラチン8/18 繊維のかく乱が細胞の集団移動を加速することをこれまで確認しており、さらに細胞間接着構造の一つであるデスモソーム構造においてケラチンなどの中間径フィラメントの係留に寄与するプラコグロビンの発現抑制の効果を解析した。その結果、プラコグロビンの発現抑制によっても集団移動の速度が上昇することが明らかとなった。また、MDCK細胞の細胞集団におけるRhoAの活性が、Soloの発現抑制によって低下することを明らかにした。これらの結果から、Soloは細胞の集団移動においてブレーキとして働き、集団の秩序を維持する機能をもつことが考えられた。また、本年度より細胞間に働く張力を可視化するテンションセンサープローブの開発に着手した。カドヘリン分子をもとにテンションセンサーの基本骨格を作製し、張力によって蛍光輝度が変化するGFPのスクリーニングを進めている。同時に、Soloの局在が細胞における機械的力の作用分布を示す可能性を検討し、Soloの集積部位が細胞の収縮力の発生部位であることを実証することに成功した。さらに詳細な検討を続けている。また、Soloに至るメカノシグナル伝達経路の探索のために、ビオチン化酵素を用いた方法でSoloと相互作用する蛋白質の探索を行い、アクチン骨格と中間径フィラメントの両方に結合する分子や接着斑に結合する分子を新たに同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞の集団移動におけるSoloの機能解析については、昨年度のケラチン8/18繊維の機能解析に続きデスモソームにおいてケラチン8/18繊維の係留に関与するプラコグロビンの関与を解析した。その結果、Soloの発現抑制によってMDCK細胞の集団移動速度がSoloの発現抑制と同様に加速することを明らかにした。これらの結果から、Soloがデスモソーム構造を介した細胞間接着において、周囲の細胞との張力の発生に寄与し、集団移動のブレーキとして機能することが示唆された。この仮説をさらに検証するために、集団移動時の細胞の移動方向の極性形成におけるSoloの関与の検討を進めている。
メカノストレス応答においてSoloの活性を制御するシグナル伝達経路を解明するために、Soloと相互作用する蛋白質の探索を行っている。新たに、大腸菌由来のビオチン化酵素を用いたBioID法を導入して探索を進めた結果、アクチン重合の促進因子であり、中間径フィラメントと結合することが報告されている蛋白質の類似分子を同定した。また、接着斑に局在する分子が同定されてきた。これらの分子の局在とSoloとの結合について現在検証を行っている。
細胞集団の移動速度の調節におけるSoloの機能を解析するため、細胞間に作用する張力を生細胞内で可視化するテンションセンサープローブの開発に着手した。蛍光蛋白質を改変して張力によって輝度が変化するものをE-カドヘリンに挿入してスクリーニングする実験方法を作成した。しかし、スクリーニングの効率に問題があり、新たな方法を計画している。これとは別に、Soloの特徴的な細胞内の局在が細胞の収縮力の発生部位と相関があることが示唆されていたため、シリコーンゴムを用いた細胞の収縮力の発生部位の可視化技術を導入し検証した。その結果、Soloが細胞基底面において収縮力を発生させている部位に集積することを証明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.テンションセンサープローブの開発：細胞間の張力を可視化するテンションセンサープローブについて、E-カドヘリンをもとに基本骨格を作製した。現在、円順列変異体YFPとさらに点変異を加えた円順列変異体YFPを使用したプローブを作製してスクリーニングを進めておりこれを継続する。さらに、シリコーンゴムに直接YFPの変異体を結合させ、シリコーンゴム引き伸ばすことでYFP変異体の任意の部位に直接張力を作用させる方法を確立する。これを用いてテンションセンサーとして機能するYFP変異体をスクリーニングする方法を確立する。また、Soloの局在と細胞が発生する収縮力のとの相関を解析して、Soloがテンションセンサーとして機能する可能性を検証する。
2.Soloと相互作用する蛋白質の網羅的探索：大腸菌由来のビオチン化酵素を用いたBioID法によってSoloと細胞内で相互作用する蛋白質の網羅的解析を継続して行う。同定される分子は、これまで得られてきた分子と合わせてメカノストレス応答における機能、ケラチン8/18ネットワークとの関連、集団移動における機能を解析する。これらの解析からSoloを介したメカノストレス応答のシグナル伝達機構の解明を目指す。
3.細胞のメカノストレス応答の時空間的制御とフィードバック機構の解析：メカノストレス応答において、力の強さを感知するためにフィードバック機構の存在が想定されている。細胞に作用する張力の可視化、Soloの局在による収縮力の発生部位の可視化といった生細胞における細胞の力負荷分布の動的状態を解析する方法を確立し、Soloの集積と収縮力の発生の時空間的相関を解析する。これらの細胞応答に対して関連分子の発現抑制や過剰発現の影響の解析を行い、力の強さを感知するフィードバック機構を解明する。
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