内在性短鎖RNAによる養殖魚の残留農薬モニタリング

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07836
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 二見 邦彦 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (00513459)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 片桐 孝之 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (50361811) ; 舞田 正志 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (60238839) ; 延東 真 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (80128355)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: miRNA / 経口曝露 / ティラピア / バイオマーカー / リアルタイムPCR / ロイコマラカイトグリーン

Outline of Annual Research Achievements

水産物の安全性確保は世界的に重要性が増してきており，生産段階での適切なリスク管理がより一層求められるようになった。しかしながら，水産養殖の過程では使用されないはずの農薬が養殖魚から検出されるなど，想定外のケースが報告されている。
近年，医学分野においては，薬の毒性評価や病気の診断のために，ヒト血漿や血清中の内在性の短鎖RNA（miRNA）をバイオマーカーとして用いる研究が盛んに進められている。一方で，養殖魚における残留農薬類のモニタリングを目的とした研究は皆無である。前年度までに，魚類のmiRNAをバイオマーカーとした，養殖魚における残留農薬類の新規モニタリングシステムを開発することを目的とし，合成抗菌剤マラカイトグリーンの代謝物であるロイコマラカイトグリーン（LMG）と有機塩素系農薬エンドスルファン（EN）の曝露によって発現が変動するmiRNAを探索した。その結果，2500 ppbのLMG曝露においてはmiR-34とmiR-199-1が，50 ppmのEN曝露においてはmiR-22a-1の発現が著しく上昇することが確認された。また，LMGの曝露では，miR-153bとmiR-22a-1も有意な発現上昇を示した。そこで本年度は，LMGが生体内に長く残留する性質を考慮し，LMGを濃度別にティラピアに経口曝露させた際にこれらのmiRNAの発現が変動するかを調べた。
miR-153b，-22a-1，-34，-199-1の発現量がLMGの体内濃度とパラレルに変動するかどうかをリアルタイムPCRにより解析ところ，これら4つのmiRNAについて，いずれもコントロール区との有意差は見られなかった。このことから，miR-34とmiR-199-1は，LMGが魚体内にある程度蓄積した状態においてのみ有用なバイオマーカーとなりうることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度において，高濃度のLMGを曝露した際に発現が変動するmiRNAとしてmiR-153b，-22a-1，-34，-199-1を同定できたことから，本年度では，LMGが生体内に長く残留する性質を考慮し，一時的にLMGを曝露させた際にこれらのmiRNAの発現が変動するか検証した。
2500 ppb以下の低濃度（2500，500，100 ppb）のLMGを経口曝露し，肝臓におけるmiR-153b，-22a-1，-34，-199-1の発現が変動するかを調べた。リアルタイムPCRの結果，いずれのmiRNAについても発現は誘導されず，繰り返しのある二元配置の分散分析においてもコントロール区との有意な差はみられなかった。このことから，LMGの一時的な曝露による残留においては，これらのmiRNAをバイオマーカーとして使用することは困難であると考えられ，実用化へ向けてはさらに低濃度のLMGに対する感度を上げていくなどの必要性が生じた。また，miRNA種は多岐にわたるため，候補となるmiRNAの数をさらに増やし，複数のmiRNAマーカーを用いることでモニタリング精度を向上させることも課題として残された。一方で，魚体内にある程度のLMGが蓄積した際には，miR-34とmiR-199-1は有用なバイオマーカーとなりうることが示唆された。
なお，同一個体を経時的にモニタリングするために，今後はこれらの候補miRNAが血漿や血清中でも発現変動するかについて明らかにしていく必要があるが，本年度は実行できなかった。

Strategy for Future Research Activity

miRNAバイオマーカーを養殖場において実用化する場合，低濃度の曝露を鋭敏に検出できるかどうかが課題となる。そのため，他のmiRNAとの併用も考慮し，新たなmiRNAを探索していく必要がある。平成29年度までは，主に薬物代謝酵素や内分泌攪乱化学物質の受容体などをターゲットとしていると推測される4種類のmiRNAに着目したが，平成30年度は，その他の既知のmiRNAにも着目する。また，クロルピリフォス（CPF）など世界（特にアジア）で広く使用されている農薬についても解析の対象とする。miRNAのバイオマーカーとしての感度や特異性については，これまでどおり，リアルタイムPCRの結果から作成したROC曲線をもとに評価する。
平成28，29年度では，すでに発現が確認されている肝臓を中心にmiRNA量の定量を行ったが，同一個体の経時的モニタリングには，血漿中miRNAの発現変動を調べることが有効である。血漿中miRNA量は肝臓に比べて少ないことが予想されるため，平成30年度では，血漿中や血清，あるいは全血を用いた微量miRNAの安定した抽出法や定量法について検討する。また，魚類由来培養細胞株EPCにENやCPFなどを添加し，培地を血漿または血清のミミックとすることで分泌型miRNAを定量することも検討する。
血漿または血清中miRNA量が農薬類の曝露により亢進する理由として，組織または有核赤血球における分泌型miRNAの転写量の上昇や，エキソソームに封入された各組織におけるmiRNAの組織障害による分泌などが考えられる。そこで，Locked Nucleic Acidプローブを用いたWhole mount in situハイブリダイゼーション法により，農薬類の曝露でmiRNAの局在がどのように変わるかを三次元的に明らかにする。