2016 Fiscal Year Research-status Report
コイヘルパーT細胞亜集団の同定－抗原特異的クローン化T細胞株を用いた検討－
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16K07881
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
森友 忠昭 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20239677)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 魚類 / ヘルパーT細胞 / IL-2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
魚類でも，ヘルパーT細胞（Th）は獲得免疫の司令塔として働くと考えられているが，Th1やTh2などのTh亜集団の存在は明らかになっていない．申請者はすでに，1個のコイTh細胞からクローン化Th細胞株を樹立することに成功しており，これらTh細胞株の性状を調べることで，魚類のTh亜集団の性状を調べた．しかし，これらコイTh細胞株は，哺乳類のTh1やTh2に特徴的なサイトカインや転写因子の発現は比較的弱く，ナイーブヘルパーT細胞様の性状を示すものが多かった．そこで28年度は，抗原特異的なT細胞を出発材料として培養下での増幅を試みた．すなわち，1尾のコイ（Responder）をあらかじめ他個体のコイ（Stimulator）白血球で免疫し，その後，両者の白血球を混合培養し，混合リンパ球反応（MLR）を行った．MLRにおいてResponderT細胞は，Stimulator白血球と混合した場合にのみ増殖したが，それ以外の個体の白血球と混合した場合は増殖しなった．また，このT細胞の増殖はシクロスポリンなどのIL-2産生を抑制する薬剤を加えることで抑制された．これらから哺乳類と同様，コイのTh細胞の増殖は，Th細胞自ら産生されるIL-2産生が重要であると考えられた．現在，これら培養下で増殖した抗原特異的なTh細胞の性状を調べるため，これら活性化Thに由来するクローン化Th株の培養に取り組んでいる．
上記のように，魚類においてもIL-2はT細胞の増殖に重要と考えられたため，大腸菌発現系を用いて，組換えコイIL-2タンパク質を作製した．そして，申請者がすでに樹立に成功しているコイTh細胞の培養に加え，その効果を調べた．その結果コイTh細胞は添加したIL-2濃度に依存して増殖したが，組換えコイIL-4/13などを加えた場合は，増殖しないことがわかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究で，哺乳類と同様コイにおいても混交リンパ球反応（MLR）にて抗原特異的なT細胞の増殖がおこること，さらに，T細胞の増殖にはIL-2が重要であることがわかった．そこで平成29年度は，MLRで増殖した抗原特異的なコイT細胞を抗原（Stimulator白血球）や組換えコイIL-2在下で培養し，1個のTh細胞に由来するクローン化T細胞株の樹立を試みる．申請者はすでにクローン化Th細胞株の樹立法の確立や組換えコイIL-2の作製をすでに終えており，準備はできている．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28度の研究では，混合リンパ球反応（MLR）を用いることで，抗原特異的なコイT細胞の増殖に成功した．すなわちResponderのコイに別の個体の白血球（Stimulator）で免疫しておき，その後，これらResponderとStimulatorの白血球を混和・培養することで，抗原特異的なTh細胞の培養が可能であることを示した．また，コイにおいてもT細胞の増殖にはIL-2の関与が重要であることもしめした．
平成29年度はこのMLRで増殖した抗原特異的なコイT細胞を抗原（Stimulator白血球）や組換えコイIL-2在下で培養し，さらなるT細胞の増幅をみる．そして我々がすでに開発している方法でクローン化Th細胞株を作製する予定である．作製されたT細胞株は，各種T細胞レセプター定常部領域（TCRα，β，γ，δ），cd4やcd8，種々のサイトカイン（IFNγ，IFNγ-rel，IL-4/13A，IL-4/13B，IL-10など），転写因子（t-bet，GATA3）の発現の有無や発現量などを調べる予定である．さらに，T細胞レセプターの可変部の塩基配列を調べ真に1個のT細胞由来であるかを調べる必要がある．
これらの解析により，従来作製が難しいかった活性化T細胞由来の細胞株であることが確認できれば，魚類においてもヘルパーT細胞亜集団の存在を調べることができると考えられる．
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