2017 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of transcriptional regulation mechanisms for natural rubber biosynthesis-related genes
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16K08138
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
高橋 征司 東北大学, 工学研究科, 准教授 (90343061)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 天然ゴム / イソプレノイド / ラテックス / パラゴムノキ / 転写制御因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
天然ゴムは合成ゴムでは完全代替不可能な優れた物性を示し、タイヤ等のゴム工業製品に不可欠な天然材料であるため、遺伝子工学的手法による天然ゴム生産能の増強が期待されている。現在、天然ゴムは、パラゴムノキの乳管細胞の細胞質に相当するラテックスより生産されている。これまでに研究代表者らは世界に先駆け天然ゴム生合成酵素およびその関連タンパク質群の同定に成功している。それらは乳管細胞内で特異的に発現しているが、その転写制御機構に関する知見はほとんど得られていなかった。本計画では、天然ゴム生合成関連タンパク質のプロモーター領域に結合する転写因子の探索と、パラゴムノキ培養細胞系をプラットフォームとした機能評価系構築により、乳管細胞において天然ゴム生合成を包括的に制御する転写制御機構を解明する。
H29年度は、ラテックスの平均化cDNAライブラリーより，ラテックス特異的に発現する天然ゴム生合成酵素およびその関連タンパク質群の5’上流プロモーター領域に対し結合しうる転写制御因子として単離された1種類の推定転写因子の機能解析を進めた。このタンパク質は細胞内において核および細胞質に局在することから，転写制御のために核移行する際に別の因子が関与する可能性が示唆された．そこで，天然ゴム生合成関連タンパク質との相互作用を解析したが，有意な相互作用は検出されなかったため，別のタンパク質との相互作用が示唆された．また，遺伝子発現解析により候補転写因子はラテックスにおいて特異的に発現することが明らかとなり，ラテックス内における天然ゴム生合成制御への寄与が想定された．また，遺伝子発現プロファイルをもとに，上記の候補とは別の転写制御因子候補を単離することができた．H30年度は，これらの候補をパラゴムノキ培養細胞で過剰発現させ，その機能解明を行う．現在，形質転換効率の高いパラゴムノキ培養細胞系の誘導を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
（1）転写因子の機能解析 前年度までに，ラテックスで特異的に発現する遺伝子の上流プロモーター領域に結合するタンパク質として，ラテックスの平均化cDNAライブラリーより一つの転写制御因子候補が単離できたため，今年度はその機能解析を進めた．候補転写制御因子の細胞内局在解析から，このタンパク質は核と細胞質に局在することがわかった．核移行のために何らかの制御を受けている可能性が示唆された．そこで，天然ゴム生合成関連タンパク質との相互作用解析を行ったが，結合タンパク質は見出せなかった．また，この転写制御因子の遺伝子発現を解析し，ラテックス特異的に発現していることが示された．一方，傷害ストレスやABA処理など，ラテックス（天然ゴム）産生誘導に関連する処理における遺伝子発現の誘導は検出できなかった．
（2）新規の候補転写制御因子の単離 ライブラリースクリーニングで単離された候補転写制御因子が一つのみであったため，他の候補を，遺伝子発現プロファイルのラテックス特異性の観点から探索した．複数の候補転写制御因子の中には，発現のラテックス特異性が特に高く，天然ゴム生合成関連遺伝子のプロモーター領域に対応するコンセンサス配列が見出せた転写制御因子が見出せたので，これを第二の候補とすることとした．
（3）形質転換培養細胞の作製 候補転写因子を過剰発現させたパラゴムノキの培養細胞の作製を試みていたが，抗生物質耐性を明確に示す形質転換カルスを得ることができなかった．維持していた懸濁細胞が継代による体細胞変異の蓄積で変質してしまったことが考えられたため，新たに懸濁培養細胞株の誘導を進めているところである．
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| Strategy for Future Research Activity |
H30年度は、H29年度に進める予定であった形質転換培養細胞の作製とそれを用いた機能解析を進めること目的として、以下の4つの項目について研究を進める．代わりに，H30年度に行う予定であった相互作用タンパク質の解析をH29年度に先行して進めていたが，全体計画に遅れが生じているため，H30年度で終了しなかった場合は研究期間の延長を申請する可能性がある．
(1) レポーターアッセイによるシス配列同定： パラゴムノキ葉肉細胞および培養細胞から調製したプロトプラストに、プロモーター領域のデリーションシリーズ及びそれらの部分変異配列をルシフェラーゼ遺伝子に連結したコンストラクトと転写因子の発現コンストラクトを導入し、転写因子結合領域に含まれるシス制御配列を明らかにする。
(2) 形質転換培養細胞の作製： 候補転写因子を、エストラジオール誘導型過剰発現が可能であるバイナリーベクターに導入し、それらで形質転換されたAgrobacteriumとパラゴムノキ培養細胞を共培養させ感染させた後に、バイナリーベクターが導入された形質転換カルスを選抜し、懸濁培養細胞化する。
(3) 形質転換培養細胞の遺伝子発現解析： 形質転換培養細胞をエストラジオール処理した後にtotal RNAを抽出し、定量的real-time RT-PCRにより候補転写因子の過剰発現を確認する。また、標的となる天然ゴム生合成関連遺伝子の発現レベルを解析し、転写因子過剰発現による効果を解析する。
(4) 天然ゴム生合成活性測定： 天然ゴム生合成関連タンパク質の発現上昇が確認された形質転換培養細胞より、粗タンパク質を調製し、それを用いてin vitroの天然ゴム生合成酵素アッセイを行う。
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| Causes of Carryover |
H29年度において進行するはずであった，形質転換パラゴムノキ培養細胞を用いた機能解析について，培養細胞株の変質が原因であると考えられる形質転換効率の低下から，形質転換株を得ることができなかった．そのため，H29年度の実験計画の多くが次年度に持ち越しとなってしまった．その研究を行うための研究予算をH30年度に使用することとなる．
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[Presentation] 天然ゴム生合成機構におけるゴム粒子の重要性2018
Author(s)
石井 智樹,末永 美樹,山下 哲,山家 史大,和氣 駿之,小島 幸 治,山口 晴彦,井之上 ゆき乃,伏原 和久,中山 亨,高橋 征司
Organizer
日本農芸化学会2018年度名古屋大会
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[Presentation] Identification and reconstitution of the rubber biosynthetic machinery from Hevea brasiliensis2017
Author(s)
Satoshi Yamashita, Haruhiko Yamaguchi, Toshiyuki Waki, Yuichi Aoki, Makie Mizuno, Fumihiro Yanbe, Tomoki Ishii, Ayuta Funaki, Yuzuru Tozawa, Yukino Miyagi-Inoue, Kazuhisa Fushihara, Toru Nakayama and Seiji Takahashi
Organizer
Plant Biology 2017
Int'l Joint Research
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