2017 Fiscal Year Research-status Report
初期嗅覚回路形成における嗅プラコード由来移動細胞の役割
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16K08454
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
村上 志津子 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (20255649)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 ちぐれ 順天堂大学, 医学部, 助教 (40536629)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 嗅プラコード / 嗅神経 / 細胞移動 / ガイドポスト細胞 / 一次嗅覚路 / ニワトリ胚 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初期の嗅神経がいかにして終脳の嗅球原基と神経結合するか、そのメカニズムについてはよくわかっていない。近年、複数の動物種において、嗅神経伸長に先だって嗅プラコード上皮から分化ニューロンマーカーを発現する細胞が間葉組織中に移動することが報告され、嗅神経路形成の最初の足がかりとして重要である可能性が想定された。ニワトリ2.5日胚では嗅プラコード上皮と終脳間に初期の移動細胞索が観察される。この初期細胞索の物理的破壊は嗅神経の前脳投射および嗅プラコード由来GnRHニューロンの脳内進入を阻害することから、初期嗅神経投射に対する細胞索の重要性が示された。今年度は、初期移動細胞の動態を調べるために、チミジンアナログのブロモデオキシウリジン（BrdU）を用いた細胞標識追跡実験を行った。移動開始前のステージ12（2日胚)にBrdU標識された嗅プラコード細胞はステージ18の細胞索に観察され、早期に発生した嗅プラコード細胞は早期に移動し、初期細胞索の構成要素となることが示された。次に嗅神経と脳との結合が明確となる6日胚でBrdU陽性細胞の分布を調べると、ステージ13にBrdU標識された嗅プラコード細胞は嗅神経と前脳の結合部外側に分布し、ステージ22（3.5日胚）にBrdU標識された細胞はこれらの領域に分布しなかった。GFP遺伝子導入によるプラコード上皮標識実験においても初期GFP標識細胞は結合部外側に位置し、後期GFP標識細胞は分布しなかった。以上の結果から、嗅神経と前脳の結合部位には、嗅プラコードで早期に発生し、早期に移動する細胞が配置することが判明した。これらの細胞の位置から、初期細胞索において終脳との接触点に位置する細胞がガイドポスト細胞である可能性が示唆された。初期に移動する嗅プラコード由来移動細胞の役割を裏付ける形態学的知見のひとつと考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．細胞標識法としてチミジンアナログのBrdUを用いて最終分裂した嗅プラコード上皮細胞を標識追跡した今回の結果は、すでに得ているGFP遺伝子導入による細胞標識追跡実験の結果を支持するものであり、初期細胞索の細胞集団に早期に移動しガイドポスト細胞として定着する細胞が存在する可能性を示す形態学的証拠のひとつである。
２．一方、初期細胞索の残存組織であると想定した6.5日胚細胞塊には、2日胚でBrdU標識された嗅プラコード細胞は観察されず、6.5日胚細胞塊の形成過程の解明には至らなかった。より遅く発生した嗅プラコード細胞が細胞塊形成に関与する可能性があり、今後の課題である。
３．神経線維マーカーを発現しない6.5日胚細胞塊の細胞特性を調べる計画については、ニューロンやグリアに対する市販抗体を用いた免疫組織化学染色による網羅的検索をおこなったが、特異性を示す結果は得られず、滞っている。
４．BrdUは胚細胞に対し毒性を有することが知られており、適正な投与量など実験条件設定に時間を取られたため、初期細胞索の役割を調べる実験として計画した細胞表面に発現するポリシアル酸（PSA）の特異的消化酵素投与によるPSA分子機能阻害実験は着手できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
初期の嗅プラコード由来移動細胞は嗅覚路形成におけるガイドポスト細胞であるという仮説の検証を進める。以下の３つを行う。
（１）早期に発生し移動する嗅プラコード細胞について、初期細胞索のどこに配置するのかを調べ、ガイドポスト細胞の特定化をめざす。最終分裂細胞を標識するチミジンアナログのBrdU あるいはEdUによる標識追跡実験を継続する。移動前の嗅プラコード細胞の標識日時を細かく設定し、初期細胞索におけるそれぞれの標識細胞の配置を調べる。特に、終脳との接触部位に配置する細胞はガイドポスト細胞の候補である。それらの細胞群の標識時期を確定し、嗅神経と脳との結合部位への定着を6日胚で調べる。
（２）初期細胞索の分子機能を調べる。細胞索の細胞表面に発現するポリシアル酸（PSA）は、細胞間の接着状態を調節し、神経突起伸長やニューロン移動に関与する。PSA特異的消化酵素のEndo-N（endoneuraminidase-N）を2.5日胚の細胞索近傍に直接投与し、嗅神経伸長やGnRHニューロン移動に対する影響を調べる。
（３）初期細胞索の最終予定運命について、長期細胞標識が可能なメダカトランスポゾンTol2-GFP発現ベクターの嗅プラコード上皮導入実験を行い、後期胚でのGFP発現細胞の分布と細胞特性を調べる。技術的問題から、エレクトロポレーションによる発現ベクターの導入は嗅プラコード全体よりは部分的であることが多く、後期胚での標識細胞数は少ないことが予測される。嗅プラコード全体の標識が可能となるGFPトランスジェニックニワトリ胚を用いた嗅プラコード交換移植キメラ胚の作成を平行して行う。GFPキメラ胚の作成が順調であれば、同様に後期胚でGFP標識細胞の予定運命を調べる。
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| Causes of Carryover |
（理由）現在得ている研究成果の投稿準備が滞り、予定していた「その他」の支出がなかったこと、および実験計画の遅れによる実験動物を含む消耗品の支出が計画予定よりも少なかったことから次年度使用額が生じた。
（使用計画）研究成果の英文雑誌への投稿準備をすみやかに進め、英文校閲代、論文投稿料として使用する予定である。また、研究計画を継続するために必要な実験消耗品の購入も予定している。
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Research Products
(2 results)
