C型とD型ボツリヌス毒素遺伝子を伝達するファージの宿主認識機構の解明とその応用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08785
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 阪口 義彦 北里大学, 医学部, 講師 (70403491)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 俊治 北里大学, 医学部, 教授 (40260765) ; 加藤 はる 国立感染症研究所, 細菌第二部, 室長 (00273136) ; 大宮 直木 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (00335035) ; 内山 淳平 麻布大学, 獣医学部, 講師 (20574619) ; 妹尾 充敏 国立感染症研究所, 細菌第二部, 主任研究官 (20646624)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ボツリヌス菌 / 人畜共通感染症 / ボツリヌス毒素遺伝子 / バクテリオファージ / 水平伝播 / ファージ変換 / ゲノム解析 / プロテオーム解析

Outline of Annual Research Achievements

ボツリヌス菌は、極めて強力な神経毒素（ボツリヌス毒素）を産生し、ヒトだけではなく、産業動物（ウシ、トリなど）に重篤な感染症（ボツリヌス症）を引き起こす。畜産現場でウシやトリにおいて、C型とD型ボツリヌス症のアウトブレイクが起きると、食品・畜産経済への損失は計り知れない。原因となるC型とD型毒素の遺伝子は、バクテリオファージ（毒素変換ファージ）により伝播されている。その伝播を阻害することにより、畜産・食品への被害を抑えるのに有効であると考えた。しかしながら、毒素変換ファージのボツリヌス菌（宿主菌）への吸着メカニズムは未だ明らかでない。今年度は、まず他のC型とD型毒素変換ファージのゲノム構造を比較するため、それぞれのファージの全塩基配列の決定を行うこととした。
種々のC型とD型毒素変換ファージ（c-468ファージ、d-1873ファージ、d-4947ファージ、c-6813ファージ、d-saファージ）の全ゲノム塩基配列を決定するため、種々のファージからDNAを精製することにしたが、思うようにファージを精製することが出来なかった。そこで、溶原株（C-468、D-1873、D-4947、C-6813、D-SA）からDNAの精製を行ったが、ボツリヌス菌では、DNaseの影響を受けやすく、完全なDNAを精製することが非常に困難であった。そこで、様々なDNA精製キットを用いて条件検討を行い、現在、約20 kb以上のDNA断片が得られた。現在、これらのDNA断片を用いて、配列決定に向けて準備を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ボツリヌス菌は、厚生労働省令で定める感染症法により、二種病原体等に分類されている。本菌を所持するためには、厚生労働省の所持許可を得る必要がある。従って、厚生労働省より、事業所【北里大学医学部微生物学】として、二種病原体等（ボツリヌス菌およびボツリヌス毒素）の所持許可（許可番号：Y05000098）を得たが、学生も立ち入る建物で二種病原体等を取り扱うことは、安全上問題ではないかとの北里大学内からの指摘があった。従って、本研究を推進するために、所持しているボツリヌス菌を他事業所【国立感染症研究所】へ譲渡し、ボツリヌス菌の保管・管理を行なうことにした。ボツリヌス菌の輸送は、研究代表者（阪口義彦）が、届出対象病原体等運搬届出書を作成し、都道府県の公安委員会（東京都公安委員会および神奈川県公安委員会）より、ボツリヌス菌の運搬の許可を得た。また、研究代表者らにより、北里大学医学部から国立感染症研究所へボツリヌス菌の輸送を行った。このような予期していない状況であったことから、計画通りに実験を進めることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

国立感染症研究所（以下、「感染研」と称する）は、既に二種病原体等の所持許可が得られていること、感染研の加藤はる氏と妹尾充敏氏は、本研究課題の研究分担者であることから、同じ施設で研究分担者らの実験および解析技術の的確なサポートを受けられる。従って、研究の支援体制が非常に整っていることから、効率よく実験が進められる。既に、研究代表者（阪口義彦）は、感染研での病原体等の安全な取扱及び管理に関するバイオリスク管理講習会において所定の課程を修了し、BSL2病原体等の取扱者として承認済み（第150684号）である。また、感染研には、実験に使用する機器（嫌気チャンバーなど）が備わっていることから、すぐにでも研究を継続できる状況にある。

Causes of Carryover

本研究計画では、大腸菌を用いて組換えファージ尾部吸着タンパク質を発現・精製を行わなわなければならない。構築した組換え体を培養するのに、恒温振盪培養器を必要とする。本機器の購入に費用がかかるため、今年度は、応募申請書に記載した計画を変更し、次年度に繰り越し研究を遂行することにした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

恒温振盪培養器を用いて組換え体（大腸菌）を培養し、組換えファージの尾部吸着タンパク質の発現・精製を行う。得られた組換えファージ尾部吸着タンパク質を機能解析する。

Research Products

• [Journal Article] Expression of tumor suppressor REIC/Dkk-3 by a newly improved adenovirus vector with insertion of an hTERT promoter at the 3’-side of the transgene. (2017)
  • Author(s): Putranto, E. W., Kinoshita, R., Watanabe, M., Sadahira, T., Murata H., Yamamoto, K., Futami, J., Kataoka, K., Inoue, Y., Ruma I M. W., Sumardika, I. W., Youyi, C., Kubo, M., Sakaguchi, Y., Saito, K., Nasu, Y., Kumon, H., Huh, N. H., Sakaguchi, M.
  • Journal Title: Oncol. Lett. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Characterization of Pseudomonas aeruginosa phage KPP21 belonging to family Podoviridae genus N4-like viruses isolated in Japan. (2016)
  • Author(s): Shigehisa, R., Uchiyama, J., Kato, S., Takemura-Uchiyama, I., Yamaguchi, K., Miyata, R., Ujihara, T., Sakaguchi, Y., Okamoto, N., Shimakura, H., Daibata, M., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 60(1) Pages: 64-67
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12347
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Analyses of short-term antagonistic evolution of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 and phage KPP22 (Myoviridae family, PB1-like virus genus). (2016)
  • Author(s): Uchiyama, J., Suzuki, M., Nishifuji, K., Kato, S., Miyata, R., Nasukawa, T., Yamaguchi, K., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Shimakura, H., Murakami, H., Okamoto, N., Sakaguchi, Y., Shibayama, K., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: App. Environ. Microbiol. Volume: 82(15) Pages: 4482－4491
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12347
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Screening of KHP30-like prophage among Japanese Helicobacter pylori strains, and genetic analysis of a defective KHP30-like prophage sequence integrated in the genome of the Helicobacter pylori strain NY40. (2016)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Takeuchi, H., Sakaguchi, Y., Ujihara, T., Daibata, M., Shimakura, H., Okamoto, N., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: FEMS Microbiol. Lett. Volume: 363(16) Pages: 1－9
  • DOI: 10.1093/femsle/fnw157
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Active secretion of dimerized S100A11 induced by the peroxisome in mesothelioma cells. (2016)
  • Author(s): Saho, S., Satoh, H., Kondo, E., Inoue, Y., Yamauchi, A., Murata, H., Kinoshita, R., Yamamoto, K., Futami, J., Putranto, E. W. Ruma, I. M., Sumardika, I. W., Youyi, C., Suzawa, K., Yamamoto, H., Soh, J., Tomida, S., Sakaguchi, Y., Saito, K., Iioka, H., Huh, N. H., Toyooka, S., Sakaguchi, M.
  • Journal Title: Cancer Microenviron. Volume: 9 Pages: 93－105
  • DOI: 10.1007/s12307-016-0185-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Analysis of botulinum neurotoxin type B6 gene-encoding plasmid in Clostridium botulinum type B. (2017)
  • Author(s): Sakaguchi, Y., Uchiyama, J., Hosomi, K., Kohda, T., Ogura, Y., Hayashi, T., Hayashi, S., Kozaki, S., Mukamoto, M.
  • Organizer: 第90回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-19 – 2017-03-21
• [Presentation] Study of adsorption of AHJD-like phages infecting Staphylococcus aureus. (2017)
  • Author(s): Uchiyama, J., Kurokawa, K., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Sakaguchi, Y., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: 第90回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-19 – 2017-03-21
• [Presentation] 新規PB1様ファージKPP22と緑膿菌PAO1株を利用した前適応ファージKPP22M作製過程の遺伝的解析 (2016)
  • Author(s): 那須川忠弥、内山淳平、鈴木仁人、西藤公司、加藤伸一郎、内山伊代、氏原隆子、島倉秀勝、村上裕信、岡本憲明、阪口義彦、柴山恵吾、阪口雅弘、松崎茂展
  • Organizer: 日本微生物生態学会第31回大会、ファージ・環境ウイルス研究合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 横須賀市文化会館（神奈川県横須賀市）
  • Year and Date: 2016-10-21 – 2016-10-22
• [Presentation] Screening of KHP30-like prophage in Helicobacter pylori using Japanese strains, and analysis of their fate by in silico approach. (2016)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Takeuchi, H., Sakaguchi, Y., Ujihara, T., Nasukawa, T., Shimakura, H., Okamoto, N., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: 日本微生物生態学会第31回大会、ファージ・環境ウイルス研究合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 横須賀市文化会館（神奈川県横須賀市）
  • Year and Date: 2016-10-21 – 2016-10-22
• [Book] ボツリヌス症の臨床症状 (2016)
  • Author(s): シリーズ！！ボツリヌス菌による疾患（ボツリヌス症）
  • Total Pages: 1
  • Publisher: サラヤ情報誌「衛生の友」
• [Book] ボツリヌス症の治療と予防 (2016)
  • Author(s): シリーズ！！ボツリヌス菌による疾患（ボツリヌス症）
  • Total Pages: 1
  • Publisher: サラヤ情報誌「衛生の友」