2016 Fiscal Year Research-status Report
ヘリコバクター・ピロリの緊縮応答の生残、定着および病原性発現における役割の解析
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16K08787
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
神谷 茂 杏林大学, 医学部, 教授 (10177587)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
花輪 智子 杏林大学, 医学部, 講師 (80255405)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ピロリ菌 / 緊縮応答 / バイオフィルム / 過酸化物感受性 / 変異株 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
緊縮応答は細菌が栄養枯渇に応答して細胞内(p)ppGppが蓄積し、主として転写に影響することで遺伝子発現を調節することで環境に適応するものである。これにより栄養源の取り込みやストレスに対する感受性などに加え、二次代謝産物の産生、病原因子の発現などが変化することが知られている。
この緊縮応答のモデュレーターである(p)ppGppは一般にRsh (RelA/SpoT homolog)タンパク質がその合成および分解を担っており、大腸菌などではRelAおよびSpoTの両方を保有する。ピロリ菌においてはSpoTのみを保有し、これにより合成、分解される。
これまでピロリ菌のspoT遺伝子が欠損すると酸化ストレスおよび薬剤感受性が亢進することが報告されているが、バイオフィルム形成能や定着に及ぼす影響については未だ報告がない。
そこで本研究では日本で分離された臨床分離株のspoT欠損変異株を作成し、ストレス感受性や環境中生残能への影響に加え、宿主への定着に関わるとされるバイオフィルム形成、正常細菌叢との相互作用および宿主細胞への影響について検討を行う。
平成28年度にはピロリ菌臨床分離株のspoT欠損変異株を作成し、ストレス感受性およびバイオフィルム形成能について検討を行った。その結果、spoT欠損によりストレス感受性の亢進、バイオフィルム形成能の低下することが明らかとなった。一方、プラスミドによる相補株の作成を試みたが、十分な遺伝子発現量が得られなかったなどの理由から目的の株を得るには至っていない。現在PCRで組換えに必要な遺伝子を含むDNA断片をPCRで合成し、形質転換により相補株を得ることを試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究ではピロリ菌宿主生残、定着における緊縮応答の役割について解析することを目的としている。本年度は臨床分離株２株を使用して緊縮応答のモデュレーターである(p)ppGpp合成酵素遺伝子欠損変異株を作成し、主としてそのストレス感受性およびバイオフィルム形成能について検討を行った。
これまでに検討を行った8株のピロリ菌の臨床分離株の形成するバイオフィルム量はほぼ同等であったが、TK1402のみが厚いバイオフィルムを形成するが明らかとなっている。これはTK1402株のAlpB 外膜タンパク質が高発現していることが要因となっているものと考えられる。そこで、標準的なバイオフィルムを形成する株としてTK1049と、この高バイオフィルム形成株であるTK1402を用いて緊縮応答欠損変異株を作成した。
得られた変異株は、高栄養条件下では親株と同等の増殖を示した。これらの株の酸化ストレス感受性を親株と比較したところ、過酸化水素に対する感受性はそれぞれの親株とほぼ同等であったが、活性酸素生成試薬であるメチルビオロゲンに対する感受性が亢進した。
一方、震とう培養後、12-well プレート内側面に形成されるバイオフィルム量をクリスタルバイオレット法により測定したところ、spoT変異ではバイオフィルム量が減少することが明らかとなった。このspoT欠損によるバイオフィルム形成能の低下はTK1402で顕著に観察されたが、TK1049株については親株のバイオフィルムが薄いこともあり、その変化率は低かった。現在、相補株の構築を行っており、次年度にはこれらの形質を確認する。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに変異株を作成し、ストレス感受性およびバイオフィルム形成について形質の変化を検討した。本年度はこの相補株の構築を完成し、in vitroでの形質変化がspoT遺伝子欠損変異によるものであることを確認する。
相補株の構築にはバイオフィルムやストレス感受性、病原性に影響しないとされるHP400遺伝子領域を組換え部位として利用し、ureA プロモーター領域、野生型spoT、カナマイシン耐性遺伝子であるaphAを連結したものに相同組換えに必要な配列を含む約5-kbのDNA断片をPCRで合成し、それを用いて変異株を形質転換する。得られた株は変異株に付加されたクロラムフェニコール耐性とカナマイシン耐性を示す。
続いて原生動物との共培養に対する影響を調査し、環境中生残に対する緊縮応答の関与ついて検討する。また、正常細菌叢構成菌のうちピロリ菌の定着を抑制するEubacteriumおよびPrevotella、または促進するClostridium leptum, Clostridium coccoides, Bifidobacterium との連続流動培養を行い、共培養条件下における増殖を検討する。
続いてsemi-vitroの実験系として、胃上皮細胞への付着性やIL-8産生誘導能を調べる。
一方、宿主定着への影響については、さらにスナネズミモデルでの定着性および病原性の解析を短期（１ヶ月）および長期（６ヶ月～１年）感染後に細菌学的、病理学的解析を行う。
変異による遺伝子発現の変化を調べる目的で、変異株のプロテオーム解析から(p)ppGppレギュロンを同定し、病原性における役割を考察する。
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| Causes of Carryover |
平成28年度に作成を試みた相補株の作成が遅れたことから形質の検討に遅れが出ている。従って、昨年に行う予定であった原生動物との共培養、胃上皮細胞への付着、影響についての検討を今年度行うため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は原生動物との共培養による生残性への影響、胃上皮細胞への付着能測定、IL-8の定量などに必要な細胞培養に関わる培地、培養容器などを購入する。また、スナネズミ感染実験を行うための動物、および飼育費用として平成29年度予算に組み込む。
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[Journal Article] Safety assessment of the Clostridium butyricum MIYAIRI 588 probiotic strain including evaluation of antimicrobial sensitivity and presence of Clostridium toxin genes in vitro and teratogenicity in vivo.2016
Author(s)
Isa K, Oka K, Beauchamp N, Sato M, Wada K, Ohtani K, Nakanishi S, McCartney E, Tanaka M, Shimizu T, Kamiya S, Kruger C, Takahashi M
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Journal Title
Hum Exp Toxicol.
Volume: 35
Pages: 818-832
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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