2017 Fiscal Year Research-status Report
光遺伝学的手法を用いたeNOS活性化によるNO合成と血管機能の調節
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16K09520
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
井上 浩一 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80345818)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐久間 英輔 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (90295585)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 血管内皮細胞 / 一酸化窒素 / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度は血管内皮細胞に光依存性カルシウム上昇が認められたため、当該年度はカルシウム上昇シグナルの下流で起こる一酸化窒素(NO)合成酵素(eNOS)の活性によるNO産生の検出を主要な目的に実験を行ってきた。蛍光顕微鏡イメージング装置を使い、NOの蛍光指示薬であるDAF-2とを用い青色光を照射したときのDAF-2の蛍光輝度の変化を継時的にモニターしたが、変化を検出できなかった。別のNO蛍光指示薬であるDAF-FMも用いて実験を行ったが、その場合も同様に検出できなかった。ただし、ポジティブコントロールであるsodium nitroprusideを投与しても検出できなかったので、蛍光フィルターの波長などイメージングシステムが蛍光指示薬の波長特性にとって最適化されていない可能性があると考えた。そこで標的を変えてNOの下流で活性化されるグアニジンシクラーゼの活性化に伴い産生されるcGMPを蛍光蛋白を用いて検出する方法を用いた。しかしながらカルシウムが上昇しない条件でも青色光でcGMPの上昇を検出してしまい、評価系として確立することができなかった。また、NOの産生を生化学的にとらえる方法も行ったが、カルシウムを上昇するための遺伝子の発現効率が低く、その産生も検出することができなかった。
また、電気穿孔法を用い、ex vivoの血管に青色光依存性カルシウム上昇を起こす遺伝子の導入を試みたが、発現効率が非常に悪く、NOなどの産生検出実験に用いることができなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度に行う予定であったNOあるいはその下流のシグナルの活性の検出ができなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度の結果から、青色光依存性カルシウム上昇を起こす遺伝子を高確率で発現する可能性がある。そのため、血管内皮細胞株にその遺伝子を発現する安定細胞株を作成しNO産生などを検出する。
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| Causes of Carryover |
実験の結果が想定通りに出なかったため、予定外の消耗品の購入が必要になったと同時に、予定していた実験が実施できなかったため、残金が生じた。
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