麻疹ウイルス感染実験系をモデルとした神経系ウイルス感染症に対する新規治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09994
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 綾田 稔 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90222702)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小島 裕正 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (40336772) ; 瀬戸 俊之 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (60423878) ; 桑村 充 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (20244668)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ウイルス / 麻疹ウイルス / 亜急性硬化性全脳炎

Outline of Annual Research Achievements

組換え麻疹ウイルスを用いて、亜急性硬化性全脳炎（SSPE）の脳内感染拡大のメカニズムを明らかにし、SSPE由来の株に生じた特徴を利用した組換えウイルスを重感染させることによってSSPEを治療する動物モデルを樹立することが目的である。
今年度は、遺伝子欠損型の組換え麻疹ウイルスを作製するために必要なN、P、L蛋白発現細胞の作製を行う目的で、レンチウイルスベクターに麻疹ウイルス野生株の遺伝子が挿入されたクローンの作製を行った。
次に、P遺伝子の変異とインターフェロン応答への影響を検討するため、麻疹ウイルス野生株、ワクチン株由来でインターフェロン応答の欠損が報告されているEdmonston-tag株、SSPE大阪1株、およびSSPE大阪2株よりP遺伝子を分離して、プラスミドへのクローン化を行った。P遺伝子にはP、V、Cの3種類の蛋白がコードされているが、これらのプラスミドよりP蛋白のみの発現プラスミド、一部の株についてはV蛋白のみの発現プラスミドを作製した。
また、SSPE大阪1株またはSSPE大阪2株のF蛋白を持ち、Edmonston-tag株のP遺伝子に置き換えた組換えウイルスを作製して、ハムスターにおける神経病原性を検討した。SSPE大阪1株のF蛋白の細胞外ドメインをもつウイルス、またはSSPE大阪2株のF蛋白の細胞外ドメインをもつウイルスは、以前の実験結果と同様、脳内接種3－4日後に過敏・けいれん等の症状を呈して発症し、数日以内に死亡した。一方、SSPE株由来のF蛋白を持ちながらP遺伝子を野生株からEdmonoston-tag株に置換したウイルスを脳内接種した場合、数時間の発症遅延の後に過敏・けいれん等の症状を呈して発症したものの、その翌日以降、急速に回復傾向を示し、1匹を除いてほとんど後遺症なく生残した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ウイルスの複製とインターフェロンの誘導・応答抑制に不可欠なP遺伝子の変異が神経病原性にも影響を与えることが今回初めて明らかになり、神経病原性を低下させる要素として、また治療への応用という観点からも、さらなる検討が必要であることが示された。特に、P遺伝子におけるどの変異が重要なのか、コードされるP蛋白、V蛋白、C蛋白に分けて解析する必要がある。また、今回のP遺伝子の変異を検討する実験においても、SSPE由来のF遺伝子を持つウイルスを用いることが有用であることが示された。
欠損型ウイルスを作製するための蛋白発現細胞の作製が遅れているが、そのためのレンチウイルスベクターへ挿入したプラスミドの作製は終了した。また、非分節型ウイルスによる分節型ウイルスの干渉現象の確認が未確認である。

Strategy for Future Research Activity

まず、作製されたSSPE株のF遺伝子を有する2分節型のウイルスの性状について、培養細胞における増殖曲線、通常のウイルスとの重感染の可能性、干渉作用の有無について検討する。また、Edmonston-tag株のP遺伝子を持つ2分節型のウイルスも作製して、非分節型のウイルスで認められた神経病原性の低下が2分節型のウイルスにおいても再現できるか否かをハムスターへの感染実験にて検討する。
次に、P遺伝子の変異とインターフェロン応答への影響について更に検討する。既にSSPE大阪1株および大阪2株のPおよびF遺伝子をもつ組換えウイルスを作製しているので、これらのウイルスの神経病原性についてハムスターへの感染実験によりSSPE株のP遺伝子の影響を野生株およびEdmonston-tag株と比較解析する。P遺伝子にはP、V、Cの3種類の蛋白がコードされていることから、P蛋白のみの発現、V蛋白のみの発現、C蛋白のみの発現プラスミドを順次作製し、それぞれのウイルス由来の蛋白についてインターフェロン応答の解析を行って比較検討する。
上記の実験と平行して、遺伝子欠損型の組換え麻疹ウイルスを作製するためのN、P、L蛋白発現細胞の作製を行う。レンチウイルスベクターを用いた方法により細胞へ導入し、発現を確認する。その後に欠損型の組換え麻疹ウイルスの作製を試みる。得られたウイルスを用いて、ハムスターへの感染実験を行う。

Causes of Carryover

概ね当初の計画どおりに進行しているが、備蓄の試薬・消耗品の利用が可能で、組換えウイルスの作製および動物実験に要した経費が少額であった。残額は次年度に繰り越して使用することが適切と判断した。
研究費は、組換えウイルスの作製および動物実験に使用する他、塩基配列の決定等のための消耗品に使用する。特に新たな高額備品は必要ではないが、実験に不可欠な基本的備品の老朽化に伴う買い換えや修理の必要が生じた場合には、機器の購入または修理費に当てる。また、これまでに達成された結果をまとめて論文にするため、論文の校正・投稿・掲載のための費用を予定している。