黄色ブドウ球菌増殖を伴う皮膚炎自然発症モデルマウスを用いた皮膚炎発症機構解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10175
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 佐々木 貴史 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70306843)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塩濱 愛子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (40383731) ; 天谷 雅行 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (90212563)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: アトピー性皮膚炎 / 細菌叢

Outline of Annual Research Achievements

Tmem79欠損マウスの皮膚炎の発症経過及び皮膚細菌叢の解明を行うために、以下の実験・解析を行った
1)3.5, 8, 32週齢のTmem79欠損マウス及びC57BL/6Nの皮膚炎及び皮膚細菌叢詳細解析
これまでの解析によりTmem79欠損マウスは経時的に皮膚炎症状の重篤度が変化することが観察されたことから、3.5, 8, 32週齢でのTmem79欠損マウスの皮膚炎症状の解析と行った。
その結果、3.5週齢では野生型マウスと比較して皮膚炎評価であるSkin severity score及び掻爬回数ともに大きかった。８週齢でSkin severity score及び掻爬回数とも改善が見られたが、32週齢では悪化していた。このことから、Tmem79欠損マウスは経時的に皮膚炎が変化することが明らかになった。
2) 3.5, 8, 32週齢のTmem79欠損マウスでの皮膚細菌叢解析
Tmem79欠損マウス3.5週齢での皮膚炎は、全身に皮膚炎が広がり、鱗屑が多く見られたのに対し、32週齢での皮膚炎は顔面領域～胸部を中心に皮膚炎が見らたが鱗屑はあまり見られなかった。Tmem79欠損マウスでは時期により皮膚炎症状に差異がみられたことから、それぞれの時期の皮膚炎領域の細菌叢を解析するために、皮膚拭い液を黄色ブドウ球菌の選択培地であるマンニット卵黄培地で培養を行った。その結果、3.5週齢では30時間以降にコロニーが形成される細菌が多く見られたのに対し、32週齢ではマンニット及び卵黄反応を示す黄色ブドウ球菌がみられた。3.5週齢でのコロニーを単離し16S rRNA領域の配列を解読した結果、Corynebacterium属であることが明らかになった。以上のことから、Tmem79欠損マウスでは週齢に応じて皮膚炎領域に存在する細菌が異なることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Tmem79欠損マウスは経時的に皮膚炎症状の重篤度及び細菌叢が変化することが観察された。3.5, 8, 32週齢から採取した皮膚拭い液の16S rRNA細菌叢解析を進めたところ、培養結果と一致する結果が得られている。しかし、皮膚細菌叢は飼育環境にも大きく影響を受けること予想されることから、生後から同ケージでコントロールとTmem79欠損マウスで飼育する必要がある。そこで、Tmem79(-/-)♂マウスとTmem79(+/-)♀マウスを交配し、妊娠確認後細菌層異常を起こさないTmem79(+/-)♀マウスのみとした後に出産させ、同腹兄弟で性別のそろったTmem79(-/-)３匹及びTmem79(+/-)３匹を選択した。これらマウスを同一ゲージで1wから24wまで飼育を行い、表現型及び16rRNA 細菌叢解析を行った。現在その結果を解析中であるが、４週齢を境として細菌叢が異なっており、12週齢付近から黄色ブドウ球菌の増殖が優勢となっていくことが明らかになっている。以上のことから、当初に計画したTmem79欠損マウスの経時的皮膚炎及び細菌叢解析は順調に推移しており、生後4週間は黄色ブドウ球菌だけでなく他の細菌が異常増殖をしていることから、SAだけでなく複数細菌の表皮での増殖性が変化していることが予想された。

Strategy for Future Research Activity

Tmem79欠損マウスにおける複数細菌の表皮での増殖性変化の原因を解明するために、当初予定したとおり、表皮最上層のSG1細胞から細胞外に分泌されるタンパク質・脂質の解析と、その結果から、Tmem79欠損マウスでの複数細菌の表皮での増殖性変化機構の解明を試みるために、以下の実験を行う。
Tmem79欠損マウスのSG1細胞及び角層での抗菌性機能解析 1) マウス皮膚からブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群原因毒素ETAを用いて、表皮最外２細胞層を表皮から分離 2) シート状に分離した表皮細胞に対し、酵素を用いて単細胞へ分離 3) 表皮細胞用の細胞培養培地を用いて培養 分離したSG細胞に対し、Il17を用いて刺激を行う。24時間培養後に細胞と培地を分離し、細胞画分に対して抗菌ペプチドを主な対象としたmRNA及びタンパク質解析、及び、培地画分に対してタンパク質、有機物、抗菌活性解析を行う。これをTmem79欠損マウス由来細胞とコントロールで比較し、Tmem79欠損により生じる抗菌成分の分泌能の違いを解析する。
Tmem79欠損マウス表皮での細菌増殖性変化の解明　1) Tmem79欠損マウス及びコントロールマウスの角層及び表皮細胞を分離し、SG1細胞で違いの見られた抗菌成分の発現及び分布について解析をおこなう。　2) Tmem79欠損マウスの皮疹部（顎下付近）と無疹部（背中）、およびコントロールマウスの顎下と背中に対し、Tmem79欠損マウスから単離した複数細菌を塗布し強制感染をさせる。その後それぞれのマウスの表皮に対し、SG1細胞で違いの見られた抗菌成分の発現及び分布について解析をおこない、Tmem79欠損による影響及び部位の差による影響を解析する。これらの結果から、Tmem79欠損マウスで起きている表皮での細菌増殖性変化の解明する。

Causes of Carryover

H28年度のマウス実験スペースは、飼育費を教室で負担していただける箇所を確保することができたことから、使用額を抑えることができた。その分は最も予算が必要となる細菌叢解析費として利用予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

細菌叢解析に必要な、マウス飼育費、消耗品、解析費として利用予定である。