T-Cell Receptor repertoire analyses in patients with esophageal cancer

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10488
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 森 隆弘 東北大学, 医学系研究科, 非常勤講師 (00323030)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安田 純 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 教授 (00281684) ; 齋藤 さかえ 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 講師 (20335491)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 食道癌 / 放射線化学療法 / T細胞受容体 / 免疫多様性 / 治療効果

Outline of Annual Research Achievements

2018年3月の時点で、末梢血白血球から抽出したgenomic DNAを対象としたTCR β CDR3領域のrepertoire解析は68症例（性別と年齢をマッチさせた健常対象６名を含む）について完了した。治療効果（再発の有無と生存期間）とD５０値『値に相当する割合のシークエンス配列パターンがシークエンスリード総数の５０％相当に占める割合；すべてのシークエンスパターンが同じコピー数であれば５０となり（５０％のシークエンスパターンが５０％のリード数に相当するという意味）最大値、特定のシークエンスパターンが多くなるほど値は小さくなる』の関係について検討した。なお、repertoire解析(D50算出）は臨床情報をマスクされた状況で行い、研究統括者が最後に予後情報とリンクさせて検討した。
CRT後の予後を１、 ５年以上生存した予後良好群；２、２年以上５年未満で癌死した中間群；３、 ２年未満で癌死した予後不良群、に基本的に分類した。５年未満の他病死は解析の対象外（「その他」）とした。５年以上経過し他病死した症例は経過良好群に含まれる。それぞれ、予後良好群n=30、中間群n=9、不良群n=7、その他n=11、治療前n=5、健常対象n=6、である。
その結果、健常対象者と、その他の各群（いずれも食道癌患者、治療前と治療後）間では統計学的有意差（p<0.001)を持って健常対象者の方がD50値は高い値、つまりより多様なTCR β CDR3クローンが存在していることが示唆された。
一方、食道癌患者の予後による各群間には有意差は認めなかったが、予後良好群にのみ、D50値が12以下となる症例が存在した。これらについては治療後に少数の特定のクローンが増大したために低いD50値を取った可能性がある。採血時期の時間軸で検討すると、これらのD50低値例はいずれもCRT開始直後にD50低値を示した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画通りに研究は進捗している。現時点での結果からは
１、年齢と性別を適合させた健常対象者と比較すると、食道癌患者では放射線化学療法(CRT)治療前後のいずれでもTCR β CDR3の多様性は有意に低い
２、多様性が極めて低い、つまりD50値が極めて低い症例（現時点では<12と想定）はCRT治療直後から出現する症例がある。これらはいずれも、その後再発なく長期間生存した症例であった
以上の結果が得られている。
特に２より示唆される、CRT治療開始直後からTCR β CDR3の多様性が急激に低下することについて、症例ごとに時系列で計測する必要が考えられたため、６名の食道癌患者に関して、治療前、治療中、終了後３、６、１２か月ごとに末梢血を採血しgenomic DNAを抽出した。

Strategy for Future Research Activity

上記の結果を受けて、CRT開始後の時系列的な解析が必要と考えられた。上記６症例について末梢血白血球からgenomic DNAを抽出しているので、それらのrepertoire解析を行う予定である。
最近、RNAを対象としたTCR repertoire解析の優位性が指摘されてきている。また、腫瘍浸潤リンパ球でのTCR解析も可能となってきたことから、上記末梢血genomic DNA解析例のうち、切除手術を受けた症例について、切除標本からRNAを抽出し、TCR repertoire解析を行うことを予定した。特に予後良好であった症例での、腫瘍部におけるTCR repertoireと末梢血中でのrepertoireで共通するクローンが存在するかどうかについて、検討したい。

Causes of Carryover

初年度に購入した試薬類の、その後の使用状況が予定より少なく済んだため、試薬類残余分で予定以上の症例の解析が可能であった。また、複数回予定した学会出張等を行わないこととした。
これは切除標本を使用した腫瘍浸潤リンパ球でのTCR repertoire解析も計画したため、この分を次年度使用として計画を変更した。切除標本からのRNAを対象とした解析が可能となり（上記参照）、本研究遂行に大いに役に立つものと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Construction of full-length Japanese reference panel of class I HLA genes with single-molecule, real-time sequencing. (2018)
  • Author(s): Mimori T, Yasuda J, Kuroki Y, Shibata TF, Katsuoka F, Saito S, Nariai N, Ono A, Nakai-Inagaki N, Misawa K, Tateno K, Kawai Y, Fuse N, Hozawa A, Kuriyama S, Sugawara J, Minegishi N, Suzuki K, Kinoshita K, Nagasaki M, Yamamoto M.
  • Journal Title: Pharmacogenomics J. Volume: 10 Pages: s41397
  • DOI: 10.1038/s41397-017-0010-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Evaluation of reported pathogenic variants and their frequencies in a Japanese population based on a whole-genome reference panel of 2049 individuals. (2018)
  • Author(s): Yamaguchi-Kabata Y, Yasuda J, Tanabe O, Suzuki Y, Kawame H, Fuse N, Nagasaki M, Kawai Y, Kojima K, Katsuoka F, Saito S, Danjoh I, Motoike IN, Yamashita R, Koshiba S, Saigusa D, Tamiya G, Kure S, Yaegashi N, Kawaguchi Y, Nagami F, Kuriyama S, Sugawara J, Minegishi N, Hozawa A, Ogishima S, Kiyomoto H, Takai-Igarashi T
  • Journal Title: J Hum Genet. Volume: 63 Pages: 213-230
  • DOI: 10.1038/s10038-017-0347-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of somatic genetic alterations in ovarian clear cell carcinoma with next generation sequencing. (2018)
  • Author(s): Shibuya Y, Tokunaga H, Saito S, Shimokawa K, Katsuoka F, Bin L, Kojima K, Nagasaki M, Yamamoto M, Yaegashi N, Yasuda J.
  • Journal Title: Genes Chromosomes Cancer. Volume: 57 Pages: 51-60
  • DOI: 10.1002/gcc.22507
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The G8 screening tool enhances prognostic value to ECOG performance status in elderly cancer patients: A retrospective, single institutional study. (2017)
  • Author(s): Takahashi M, Takahashi M, Komine K, Yamada H, Kasahara Y, Chikamatsu S, Okita A, Ito S, Ouchi K, Okada Y, Imai H, Saijo K, Shirota H, Takahashi S, Mori T, Shimodaira H,Ishioka C.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12 Pages: e0179694.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0179694
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Efficacy and safety of gemcitabine plus docetaxel in Japanese patients with unresectable or recurrent bone and soft tissue sarcoma: Results from a single-institutional analysis. (2017)
  • Author(s): Takahashi M, Komine K, Imai H, Okada Y, Saijo K, Takahashi M, Shirota H, Ohori H, Takahashi S, Chiba N, Mori T, Shimodaira H ;Ishioka C.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12 Pages: e0179694.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0176972
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genome-wide identification of inter-individually variable DNA methylation sites improves the efficacy of epigenetic association studies. (2017)
  • Author(s): Hachiya T, Furukawa R, Shiwa Y, Ohmomo H, Ono K, Katsuoka F, Nagasaki M, Yasuda J, Fuse N, Kinoshita K, Yamamoto M, Tanno K, Satoh M, Endo R, Sasaki M, Sakata K, Kobayashi S, Ogasawara K, Hitomi J, Sobue K, Shimizu A.
  • Journal Title: NPJ Genom Med. Volume: 13 Pages: s41525
  • DOI: 10.1038/s41525-017-0016-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genetic analysis of Japanese primary open-angle glaucoma patients and clinical characterization of risk alleles near CDKN2B-AS1, SIX6 and GAS7. (2017)
  • Author(s): Shiga Y, Nishiguchi KM, Kawai Y, Kojima K, Sato K, Fujita K, Takahashi M, Omodaka K, Araie M, Kashiwagi K, Aihara M, Iwata T, Mabuchi F, Takamoto M, Ozaki M, Kawase K, Fuse N, Yamamoto M, Yasuda J, Nagasaki M, Nakazawa T
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 20 Pages: e0186678
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0186678
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A Histologic Categorization of Aqueous Outflow Routes in Familial Open-Angle Glaucoma and Associations With Mutations in the MYOC Gene in Japanese Patients. (2017)
  • Author(s): Hamanaka T, Kimura M, Sakurai T, Ishida N, Yasuda J, Nagasaki M, Nariai N, Endo A, Homma K, Katsuoka F, Matsubara Y, Yamamoto M, Fuse N.
  • Journal Title: Invest Ophthalmol Vis Sci. Volume: 58 Pages: 2818-2831
  • DOI: 10.1167/iovs.16-20646
  • Peer Reviewed / Open Access