血中エクソソームを利用した膵癌タイプ別分類に基づくテーラーメード治療の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10590
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 山田 豪 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (30467287)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高見 秀樹 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (40723028) ; 藤井 努 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (60566967) ; 小寺 泰弘 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10345879)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 膵癌 / EMT / 術前診断

Outline of Annual Research Achievements

われわれは「上皮間葉転換(EMT)」が膵癌を含むさまざまな消化器癌において癌の浸潤・転移のメカニズムとして重要であることを報告してきた。一方、日常臨床の経験から、膵癌は「局所進展タイプ」と「遠隔転移タイプ」に大きく二分されると考えている。したがって、各々のタイプに応じた治療法の確立が求められることから、EMTを膵癌のタイプ別分類に利用することを着想した。
また、消化管癌と異なり、術前に腫瘍組織を採取することが一般的ではない膵癌においては、「血中癌細胞由来エクソソーム」を利用したリキッドバイオプシーにより術前診断を行うことが有用である。本研究では非侵襲的かつ理想的なリキッドバイオプシーにより膵癌の術前タイプ別分類法を確立し、集学的治療をテーラーメード化し、治療成績を向上させることを目的としている。
本研究はin vitroとin vivoで得られた結果を膵癌切除患者の血液サンプルにて検証することとした。初年度として、膵癌細胞株の培養上清からエクソソームを抽出・精製し、網羅的解析により膵癌をEMTの見地から「局所進展タイプ」と「遠隔転移タイプ」に分類することが可能なmiRNAのリストアップを行った。来年度からの予定として、上皮系と間葉系膵癌細胞株のマウスモデルを作成して経時的に血液採取を行い、エクソソーム内のmiRNAやタンパクを測定し、群間にて比較検討を行う。最終的には、膵腫瘍切除患者の血液サンプルにてエクソソーム内のmiRNAやタンパクを測定し、群間比較、臨床病理学的因子、予後、再発形式との相関、悪性化への関与を解析する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでのわれわれの研究報告より、膵癌細胞株においてはEMTに関する上皮系あるいは間葉系細胞のステータスが既に判明しているため(Yamada S, Fuchs BC. Surgery 2013)、本研究においては上皮系細胞株と間葉系細胞株として典型的な膵癌細胞株をそれぞれ2種類ずつ使用し、研究を開始することとした。これらの膵癌細胞株を培養し、培養上清からエクソソームを超遠心法により回収した。その後、表面マーカーに対するビーズを用いたフローサイトメトリーによりエクソソームの精製を行った。この段階において、正確にエクソソームが抽出されているか否かを確認するため、電子顕微鏡にて抽出したエクソソームを視覚的にも確認した。
その後、先の作業にて抽出したエクソソームにおいて、miRNAの発現につき網羅的に解析を行うこととした。当初の研究計画においては、エクソソームからタンパクの抽出を行う予定であったが、安定して抽出することが困難と判断したため、miRNAから着手することとした。現在、miRNAの網羅的発現解析が終了したところであり、上皮系細胞株と間葉系細胞株において有意に高発現もしくは低発現しているmiRNAをリストアップし、中でも最も有力な候補を同定する予定である。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度の研究結果をもとに、平成29年度は臨床検体を用いた測定・解析を行う予定である。教室で切除を行った2011年から2015年までの①膵癌患者、②IPMN患者、③その他膵腫瘍患者および④健常者の血液からエクソソームを抽出・精製し、先の「miRNA」の発現を測定する。4群間の比較だけでなく、膵癌患者においては臨床病理学的因子、予後、再発形式（局所再発、肝転移、腹膜播種、肺転移）との相関、その他の膵腫瘍においては悪性化への関与を解析する。
並行して、動物実験も開始する予定である。ヌードマウスに対して、EMTにおける上皮系と間葉系膵癌細胞株それぞれの皮下腫瘍モデルを作成し、尾静脈より経時的に血液採取を行う。採取した血液からエクソソームを抽出・精製し、先に同定した「miRNA」の発現をそれぞれ測定し、比較検討を行う。これにより、間葉系細胞株を用いたマウスモデルにおいては、上皮系細胞株のマウスモデルと比較して「miRNA」が血中エクソソーム内に有意に高発現していることを立証する。さらにまた、上皮系細胞株によるマウスモデルに対して、間葉系細胞株のマウスモデルの血中から抽出・精製したエクソソームを尾静脈に同時注射し、皮下腫瘍の増大だけでなく、転移・浸潤能についても機能解析を行い、エクソソームあるいは「miRNA」による上皮系腫瘍の間葉化について検証する。

Causes of Carryover

エクソソーム抽出と網羅的解析においては、順調に実施することができた。特に、エクソソーム抽出は超遠心法により施行できたため、コストを低減させることができた。さらにまた、初年度ということもあり、学会発表・論文発表が出来なかったため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

各種学会・論文などへの研究成果の発表に使用する予定である。