2016 Fiscal Year Research-status Report
軟骨・血球分化とがん抑制に関わるスプライシング制御機構の研究
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16K10887
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
池田 敏之 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80322759)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | スプライシング / 軟骨再生 / 血液型D抗原 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
EMX2によるスプライシングアッセイ用のベクターは、RhD L320L変異の系で検証したところうまくワークしなかった。そこでp63のexon 12 と14を用いて再度Halo-tag, GFP-tag付のカセットベクターを作成し同様の検討を行ったところ、ワークすることが確認できた。このカセットベクターを用いてRhD exon 6, 7, 9のWeakD/Del原因変異についてスプライシング異常の有無を検討した。既知のK409K変異でエクソンスキップが確認されたほか、V319Vでエクソン7の正常なスプライシングの減弱が確認された。RhD L320L変異のエクソンスキップの原因を検討したところ、in silicoで予測されたSRSF1と変異部位RNAとの結合はRNA-EMSAやRNA pulldown assay では確認されず、他のSRSF分子が関与すると考えられた。候補SRSF計13分子の一過性発現ベクターを作成してRhDミニ遺伝子と同時導入し、splicing patternへの影響を評価した。positive な変化パターンを呈する複数の候補分子と、正常スプライシングを完全に阻害するSRSF3が同定された。p63, VHL, RhD, EMX2の安定発現・スプライシング解析用のミニ遺伝子を作成した。p63 exon 12-14 のミニ遺伝子にHalo-tag, GFP-tagをつけたものをATDC5, HeLaに安定導入し細胞株クローンを作成した。細胞株へのSRSF一過性強制発現系により軟骨分化誘導能のスクリーニングを行った結果、軟骨分化誘導分子の候補としてSRSF1, SRSF5, SRSF11, TRA2Bが示された。アデノウィルス発現系を作成しヒト間葉系幹細胞に導入したところ、SRSF1, SRSF11, TRA2Bの強制発現系に軟骨分化誘導が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
EMX2を用いたカセットベクターはうまくワークしなかったが、かわりにp63を用いてHalo-tag, GFP-tag 2種類のtag をつけたカセットベクターを作成しうまくワークすることを確認できた。カセットベクターの作成に時間がかかったため遺伝子変異の解析はRhD遺伝子のみとなっているが、従来機序が不明であったc.957G>A変異のスプライシング異常を確認することに成功した。安定導入によるスプライシングアッセイのためのミニ遺伝子は当初の予定通りalternative splicing を受けるexonをすべて含んだものとすることはできなかったが、予定通り4遺伝子すべてに対し作成することができた。一部安定導入細胞株の作成を前倒しで行っている。SRSFファミリー分子については強制発現系の構築が完全に終了し、一部機能解析を行うことで、SRSFファミリー分子の中に軟骨分化誘導に重要な役割をもつ分子がある可能性を示すことができた。予定以上の進捗状況のものと、予定よりやや進捗状況が遅れているものが混在しており、全体としてはおおむね順調に進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
とくにRhDのDel/WeakDの原因変異に着目しH28年度に作成したp63のexon 12 と14を利用したHalo-tag, GFP-tag付のカセットベクター（Halo-p63beta-Cas, Gp63beta-Cas）を用いて遺伝子変異によるスプライシング異常の有無を検証する。またRhDのexon 7を含むhnRNAと結合している可能性が強い、SRSF3およびその他のSRSFファミリー分子について、実際の結合の有無をRNA-EMSAやRNA pulldown assay/western blotting にて検証する。ATDC5やHeLaにp63のミニ遺伝子を安定導入したアッセイ用のクローン細胞株を用いて、インスリン投与による軟骨分化誘導や薬剤投与・紫外線照射によるアポトーシス誘導を実際に行って、スプライシングパターンの変化を検証する。またRhDやVHL, EMX2についてもミニ遺伝子導入安定細胞株クローンの作成を開始する。ヒト間葉系幹細胞にSRSF分子を強制発現させて軟骨分化を誘導する系において、軟骨分化のキー分子の発現調節やスプライシングパターンの変化をRT-PCRでより詳細に検証し、これらSRSF分子の標的遺伝子を探索する。
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[Journal Article] Regulation of Chondrocyte Survival in Mouse Articular Cartilage by p63.2017
Author(s)
Taniguchi Y, Kawata M, Ho Chang S, Mori D, Okada K, Kobayashi H, Sugita S, Hosaka Y, Inui H, Taketomi S, Yano F, Ikeda T, Akiyama H, Mills AA, Chung UI, Tanaka S, Kawaguchi H, Saito T.
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Journal Title
Arthritis Rheumatology
Volume: 69
Pages: 598-609
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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