2017 Fiscal Year Research-status Report
骨髄間葉系前駆細胞を用いた次世代型血管新生療法の基礎的解析
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16K11384
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
大西 清 東邦大学, 医学部, 教授 (30194228)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 恵美 東邦大学, 医学部, 准教授 (50318242)
赤坂 喜清 東邦大学, 医学部, 教授 (60202511)
荻野 晶弘 東邦大学, 医学部, 講師 (70385657)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Fibrocyte / bFGF / 血管新生 / 組織修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組織修復において出現する線維芽細胞の由来は長年不明であったが，近年一部の線維芽細胞は骨髄細胞由来であることが判明しFibrocyteと名付けられた．FibrocyteはFibroblastとLeukocyteの両方の特徴を持ち，白血球抗原と細胞外基質マーカーの二重染色で同定される細胞の総称である．
これまでの研究では，組織修復過程においてbFGF投与後のラット皮膚肉芽組織をCD34とProcollagen1の蛍光二重染色を行うと両者が共発現しているFibrocyteが同定された．このFibrocyteは薄い壁を有する管腔様構造を作り，その中に赤血球が確認でたことから新生された毛細血管であると考えられた．即ち，bFGFにより集積したfibrocyteが血管内皮様構造を形成し，血管新生に関与していることをin vivoの実験系で証明した．
現在は，このin vivoで確認されたFibrocyteによる血管新生をさらに検証するため，肉芽組織から修復細胞を単離してFibrocyteの発現性や血管新生性についてin vitroで検討を行っている．具体的には，SDラット背部に全層性皮膚潰瘍を作成し，創部にbFGFを投与後，そこに形成された肉芽組織から修復細胞を単離し，コラーゲンゲル培地にて３次元回旋培養を行った．コラーゲンゲル内に増殖したFibrocyteについて検討を行ったところ，bFGF投与群ではコントロール群に比して有意な管腔様構造の形成を認めた．これらの細胞のCD34とProcollagen1の蛍光二重染色を行うと両者が共発現しているFibrocyteが同定された．またRT-PCRによる定量的解析では，bFGF投与群においてCD34の有意な発現増加が確認された．このことは，in vitroにおいてもbFGF誘導性fibrocyteによる血管様構造形成を示唆するものと考えられた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラット皮膚の正常修復過程およびbFGF投与下におけるFibrocyte発現解析の実験系を確立した．またin vitroにおけるFibrocyteの発現解析を行うためにコラーゲンゲルを用いた三次元培養の実験系を確立した．組織修復過程で生じた肉芽組織をコラーゲンゲルにて三次元培養を行い，Fibrocyteの増殖と血管様構造の新生を証明した．
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| Strategy for Future Research Activity |
bFGFによる皮膚潰瘍部肉芽組織の血管新生では，Fibrocyteの直接的関与を証明した．またin vitroにおいても血管新生におけるFibrocyteの関与を証明した．今後は，in viroにおけるFibrocyteとbFGFの関連性をさらに検索するとともに，Fibrocyte移植による新規の血管新生療法のため，最適な培養法の確立を行い，CD34+/procollagenⅠ+fibrocyteをラット皮膚潰瘍へ移植し，血管新生能や組織修復能の変化を観察する．
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| Causes of Carryover |
―理由―
次年度にラット皮膚潰瘍肉芽組織からCD34+/procollagenⅠ+fibrocyteの単離を行い，コラーゲンゲルによる培養実験を行う予定である．高額なコラーゲンゲル培地や試薬（免疫染色，PCRに使用）を複数購入する必要があるため，本年度の予算の一部を次年度に繰り越した．
―使用計画―
ラット背部に全層性皮膚欠損を作成し，bFGF投与群とコントロール群の肉芽組織を採取したのち，破砕してフローサイトメトリー装置を用いてfibrocyteを同定する．同定されたfibrocuteはコラーゲンゲルにて三次元的に培養を行う．これらの実験を行うために，実験動物(SDラット，日本クレア社)，コラーゲンゲル（collagen typeⅠ），培養器具を購入予定である．増幅したfibrocyteは，免疫染色法やRT-PCRを施行し解析を行う．これらの実験では，CD34(Abcam,ab150060)をはじめとする免疫染色用の抗体，PNA抽出用の試薬，RT-PCR用の各種試薬を購入予定である.
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