ヒト骨格筋幹細胞を用いた歯槽骨再生におけるIL-35の役割の検討

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11845
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 三谷 章雄 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (50329611)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 菊池 毅 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (40421242) ; 尾関 伸明 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (70469005) ; 茂木 眞希雄 愛知学院大学, 薬学部, 准教授 (00174334) ; 梅村 正幸 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 准教授 (90359985)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: IL-35 / IL-17 / ヒト骨格筋幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

炎症や感染防御において注目されているTh17細胞から産生されるIL-17は、リウマチ患者の滑膜より検出され、RANKLを誘導することにより破骨細胞を介した骨吸収に関与していることも明らかとなっている。歯周病において、Th17細胞やTreg細胞の関与が示唆されており、歯周病病態におけるこれらT細胞や関連サイトカインの役割について更なる研究が必要である。主にTreg細胞より産生される抑制性サイトカインのIL-35は、コラーゲン誘導性リウマチを抑制すること、Th17細胞分化を抑制することが知られている。我々は、これまでに歯周病患者は健常者よりIL-35発現/産生が有意に高いことを報告してきているが、骨代謝および骨再生に関するIL-35の役割は未だ不明である。本研究では効率的な骨再生システムを模索するために、特に幹細胞から骨芽細胞の分化過程におけるIL-35の役割を明らかにすることを目的としている。
平成28年度は、BMP-2を用いたα7integrin陽性ヒト骨格筋幹細胞から骨芽細胞様細胞への分化誘導時におけるIL-35やIL-17の影響を検討する実験から始めているのだが、UCSF（Dr. Randall H. Kramer, Professor of Cell and Tissue Biology, School of Dentistry, UCSF, USA）から供与されたヒト骨格筋幹細胞の増殖培養の時点で苦慮した。同幹細胞を20%FCS含有Ham’s F10 Nutrient Mix培地にて培養を行ったところ、細胞のディッシュ（シャーレ）上での定着および細胞増殖に関して、不具合が生じている。予定外ではあるが、最適な条件を再設定する必要があるため、細胞培養の各種条件（FCSの使用ロット等）を見直しており、ある程度の良好な条件が設定できてきたため、次年度は引き続き、遺伝子発現解析等の実験を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成28年度はUCSF（Dr. Randall H. Kramer, Professor of Cell and Tissue Biology, School of Dentistry, UCSF, USA）から供与されたヒト骨格筋幹細胞を用いて、骨芽細胞に分化培養し、IL-35やIL-17を添加して遺伝子発現の変化等を解析していく予定であった。しかしながら、予定外ではあるが、供与されたヒト骨格筋幹細胞の増殖培養の時点で、ディッシュ（シャーレ）上での細胞の定着および細胞増殖に関して、不具合が生じ苦慮した。そのため、最適な培養条件を再設定する必要性が発生し進捗が遅れた。

Strategy for Future Research Activity

供与されたヒト骨格筋幹細胞の培養条件に関して、何度も試行錯誤して再設定してきた結果、FCSの使用ロット等の添加因子等の培養時条件を見直し、ある程度の良好な条件が設定できてきている。また、培養条件に関しては、特に生体環境を踏まえて細胞培養に用いるディッシュをTypeⅠcollagenコーティングすることで、より細胞が増殖・分化しやすい環境も模索している。さらに、細胞の遺伝子発現動態や細胞の挙動は細胞外の微小環境により細やかに制御されていることから、より生体内に近い微少環境を再現するため、ハンギングドロップ法（培養ディッシュの蓋の内面で細胞懸濁液の液滴を懸垂させ、液滴あたりに一つの細胞塊を形成する）で細胞塊を作製し、その後各種リコンビナントタンパク質を加えることで細胞増殖能等の解析も行ってみる予定である。次年度は、上記の如く様々な培養条件にて、遺伝子発現解析等の実験を行い、安定的なデータ獲得が出来るか否かの確認を確実に行った上で、本研究を進める予定である。

Causes of Carryover

UCSFから供与されたヒト骨格筋幹細胞を用いて、骨芽細胞に分化培養し、IL-35やIL-17を添加して遺伝子発現の変化等を解析していく予定であったが、ヒト骨格筋幹細胞の増殖培養の時点で、ディッシュ（シャーレ）上での細胞の定着および細胞増殖に関して、不具合が生じ苦慮した。そのため、最適な培養条件を再設定する必要性が発生し、実験計画が滞ってしまっているため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

供与されたヒト骨格筋幹細胞の培養条件に関して、何度も試行錯誤して再設定してきた結果、ある程度の良好な条件が設定できてきている。また、培養条件に関しては、特に生体環境を踏まえて細胞培養に用いるディッシュをTypeⅠcollagenコーティングすることで、より細胞が増殖・分化しやすい環境も模索している。さらに、細胞の遺伝子発現動態や細胞の挙動は細胞外の微小環境により細やかに制御されていることから、より生体内に近い微少環境を再現するため、ハンギングドロップ法で細胞塊を作製し、その後各種リコンビナントタンパク質を加えることで細胞増殖能等の解析も行ってみる予定である。次年度は、上記の如く様々な培養条件にて、遺伝子発現解析等の実験を行い、安定的なデータ獲得が出来るか否かの確認を確実に行った上で、本研究を進める予定である。遅れてしまった実験は次年度において行うため、生じた次年度使用額はそれに充当する。

Research Products

• [Journal Article] Effect of interleukin (IL)-35 on IL-17 expression and production by human CD4+ T cells. (2017)
  • Author(s): Okada K, Fujimura T, Kikuchi T, Aino M, Kamiya Y, Izawa A, Iwamura Y, Goto H, Okabe I, Miyake E, Hasegawa Y, Mogi M, Mitani A.
  • Journal Title: PeerJ Volume: 5 Pages: e2999,
  • DOI: 10.7717/peerj.2999.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] F-spondin negatively regulates dental follicle differentiation through the inhibition of TGF-β activity. (2017)
  • Author(s): Orimoto A, Kurokawa M, Handa K, Ishikawa M, Nishida E, Aino M, Mitani A, Ogawa M, Tsuji T, Saito M.
  • Journal Title: Arch Oral Biol Volume: 79 Pages: 7-13
  • DOI: 10.1016/j.archoralbio.2017.02.019.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] IL-15 and RANKL Play a Synergistically Important Role in Osteoclastogenesis. (2017)
  • Author(s): Okabe I, Kikuchi T, Mogi M, Takeda H, Aino M, Kamiya Y, Fujimura T, Goto H, Okada K, Hasegawa Y, Noguchi T, Mitani A.
  • Journal Title: J Cell Biochem Volume: 118(4) Pages: 739-747
  • DOI: 10.1002/jcb.25726.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] New Irradiation Method with Indocyanine Green-Loaded Nanospheres for Inactivating Periodontal Pathogens. (2017)
  • Author(s): Sasaki Y, Hayashi JI, Fujimura T, Iwamura Y6, Yamamoto G, Nishida E, Ohno T, Okada K, Yamamoto H, Kikuchi T, Mitani A, Fukuda M.
  • Journal Title: Int J Mol Sci Volume: 18(1). pii Pages: E154
  • DOI: 10.3390/ijms18010154.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Assessment of oral malodor and tonsillar microbiota after gargling with benzethonium chloride. (2016)
  • Author(s): Iwamura Y, Hayashi J, Sato T, Sato S, Murakami T, Fujimura T, Sasaki Y, Okada K, Takahashi E, Kikuchi T, Aino M, Noguchi T, Shimazaki Y, Mitani A, Fukuda M.
  • Journal Title: J Oral Sci Volume: 58(1) Pages: 83-91
  • DOI: 10.2334/josnusd.58.83.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Anti-inflammatory role of glucose-dependent insulinotropic polypeptide in periodontitis. (2016)
  • Author(s): Suzuki Y, Nakamura N, Miyabe M, Nishikawa T, Miyajima S, Adachi K, Mizutani M, Kikuchi T, Miyazawa K, Goto S, Tsukiyama K, Yamada Y, Ohno N, Noguchi T, Mitani A, Matsubara T, Naruse K.
  • Journal Title: J Diabetes Investig Volume: 7(4) Pages: 497-505
  • DOI: 10.1111/jdi.12450.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Adhesion Properties of Human Oral Epithelial-Derived Cells to Zirconia. (2016)
  • Author(s): Okabe E, Ishihara Y, Kikuchi T, Izawa A, Kobayashi S, Goto H, Kamiya Y, Sasaki K, Ban S, Noguchi T, Kawai T, Mitani A.
  • Journal Title: Clin Implant Dent Relat Res Volume: 18(5) Pages: 906-916
  • DOI: 10.1111/cid.12369.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Role of Mfa5 in Expression of Mfa1 Fimbriae in Porphyromonas gingivalis. (2016)
  • Author(s): Hasegawa Y, Iijima Y, Persson K, Nagano K, Yoshida Y, Lamont RJ, Kikuchi T, Mitani A, Yoshimura F.
  • Journal Title: J Dent Res Volume: 95(11) Pages: 1291-1297
  • DOI: 10.1177/0022034516655083.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Serum Amyloid A Promotes E-Selectin Expression via Toll-Like Receptor 2 in Human Aortic Endothelial Cells. (2016)
  • Author(s): Nishida E, Aino M, Kobayashi SI, Okada K, Ohno T, Kikuchi T, Hayashi JI, Yamamoto G, Hasegawa Y, Mitani A.
  • Journal Title: Mediators Inflamm Volume: 2016 Pages: 7150509
  • DOI: 10.1155/2016/7150509.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 上顎第一小臼歯と上顎第一第臼歯を抜去し治療を行った、歯周炎を伴うハイアングル上顎前突症例 (2016)
  • Author(s): 柴田桃子、宮澤健、田淵雅子、相野誠、竹口篤士、三谷章雄、後藤滋巳
  • Organizer: 第75回日本矯正歯科学会大会
  • Place of Presentation: アスティとくしま（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2016-11-07 – 2016-11-07
• [Presentation] ヒト歯肉上皮細胞におけるIL-35の影響について (2016)
  • Author(s): 岡田康佑, 藤村岳樹, 菊池毅, 相野誠, 神谷洋介, 伊澤有郎, 後藤久嗣, 岡部猪一郎, 三宅永莉子, 三谷章雄
  • Organizer: 第145回日本歯科保存学会秋季学術大会
  • Place of Presentation: キッセイ文化ホール（長野県松本市）
  • Year and Date: 2016-10-27 – 2016-10-27
• [Presentation] インターロイキン 1レセプター アンタゴニスト（IL-1Ra）のコラゲナーゼ3（MMP-13）発現抑制について (2016)
  • Author(s): 後藤久嗣，石原裕一，菊池 毅，伊澤有郎，尾関伸明，神谷洋介，中田和彦，前田初彦，野口俊英，三谷章雄
  • Organizer: 第23回日本歯科医学会総会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-10-21 – 2016-10-21
• [Presentation] Glucose-dependent Insulinotolopic Polypeptide(GIP)による歯周病抑制効果の検討 (2016)
  • Author(s): 鈴木佑基、成瀬桂子、中村信久、宮部愛、宮島真一、菊池毅、宮澤健、後藤滋巳、松原達昭、三谷章雄
  • Organizer: 第23回日本歯科医学会総会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-10-21 – 2016-10-21
• [Presentation] マイクロCT撮影による日本人上顎大臼歯の歯根陥凹度と根管数との関係 (2016)
  • Author(s): 加藤彰子、内海倫也、菱川敏光、山本弦太、稲垣幸司、三谷章雄、本田雅規
  • Organizer: 第23回日本歯科医学会総会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-10-21 – 2016-10-21
• [Presentation] アンジオポエチン様タンパク２は歯肉上皮細胞におけるPorphyromonas gingivalis菌由来LPSによる炎症反応を制御する (2016)
  • Author(s): 大野祐, 山本弦太, 林潤一郎, 西田英作, 後藤久嗣, 岡田康佑, 佐々木康行, 村瀬尚子, 茂木眞希雄, 福田光男, 三谷章雄
  • Organizer: 第59回秋季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ（新潟県新潟市）
  • Year and Date: 2016-10-07 – 2016-10-07
• [Presentation] ヒト口腔由来上皮細胞のジルコニアに対する付着特性 (2016)
  • Author(s): 岡部栄治郎, 菊池毅, 石原裕一, 後藤久嗣, 相野誠, 河合逹志, 三谷章雄, 村上弘
  • Organizer: 第46回秋季日本口腔インプラント学会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2016-09-17 – 2016-09-17
• [Presentation] Porphyromonas gingivalis LPS induced the production of Angiopoietin-like protein2 in gingival epithelial cells. (2016)
  • Author(s): Tasuku Ohno, Genta Yamamoto, Eisaku Nishida, Jun-ichiro Hayashi, Hisashi Goto, Makio Mogi, Akio Mitani
  • Organizer: 2016 Annual Meeting of American Academy of Periodontology
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, CA, USA)
  • Year and Date: 2016-09-13 – 2016-09-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] IL-15 and RANKL play a synergistically important role in osteoclastogenesis. (2016)
  • Author(s): Iichiro Okabe, Takeshi Kikuchi, Makio Mogi, Hiroaki Takeda, Kyoko Sasa, Toshihide Noguchi, Akio Mitani
  • Organizer: 2016 Annual Meeting of American Academy of Periodontology
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, CA, USA)
  • Year and Date: 2016-09-13 – 2016-09-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Interleukin (IL)-35 and IL-17 may play important role in periodontitis. (2016)
  • Author(s): Akio Mitani, Kosuke Okada, Hisashi Goto, Yosuke Kamiya, Takeki Fujimura, Makio Mogi, Makoto Aino, Toshimitsu Hishikawa, Toshihide Noguchi, Takeshi Kikuchi.
  • Organizer: 2016 Annual Meeting of American Academy of Periodontology
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, CA, USA)
  • Year and Date: 2016-09-13 – 2016-09-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 全身性エリテマトーデスを伴う慢性歯周炎患者の長期経過症例 (2016)
  • Author(s): 稲垣幸司，三浦依保美，加藤万理，三谷章雄
  • Organizer: 第４回日本病巣疾患研究会
  • Place of Presentation: TKPガーデンシティ永田町（東京都千代田区）
  • Year and Date: 2016-09-11 – 2016-09-11
• [Presentation] 天然物を配合した歯磨き剤による歯周病改善効果 (2016)
  • Author(s): 服部幸治、佐藤千奈、高木寛、八代洋一、中田悟、山本弦太、三谷章雄
  • Organizer: 第33回和漢医薬学会学術大会
  • Place of Presentation: 星薬科大学（東京都品川区）
  • Year and Date: 2016-08-27 – 2016-08-27
• [Presentation] Antimicrobial photodynamic therapy using a laser transmitted through soft tissue. (2016)
  • Author(s): Yasuyuki Sasaki, Jun-ichiro Hayashi, Yuki Iwamura, Kousuke Okada, Takeki Fujimura, Eisaku Nishida, Makoto Aino, Takeshi Kikuchi, Hiromitsu Yamamoto, Akio Mitani, Mitsuo Fukuda
  • Organizer: The 15th Congress of the World Federation for Laser Dentistry
  • Place of Presentation: WINC AICHI (Nagoya, Aichi, Japan)
  • Year and Date: 2016-07-17 – 2016-07-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Fundamental assessment of irradiation method for antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) using a laser transmitted through soft tissue. (2016)
  • Author(s): Yuki Iwamura, Jun-ichiro Hayashi, Yasuyuki Sasaki, Kosuke Okada, Takeki Fujimura, Eisaku Nishida, Makoto Aino, Takeshi Kikuchi, Hiromitsu Yamamoto, Akio Mitani, Mitsuo Fukuda
  • Organizer: The 15th Congress of the World Federation for Laser Dentistry
  • Place of Presentation: WINC AICHI (Nagoya, Aichi, Japan)
  • Year and Date: 2016-07-17 – 2016-07-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 歯周ポケット外照射を想定したaPDTについて (2016)
  • Author(s): 佐々木康行, 林潤一郎, 岩村侑樹, 岡田康佑, 藤村岳樹, 西田英作, 相野誠, 菊池毅, 山本浩充, 三谷章雄, 福田光男
  • Organizer: 第28回日本レーザー歯学会学術大会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2016-07-16 – 2016-07-16
• [Presentation] クラスター解析を用いた口臭患者の口蓋扁桃細菌叢データと臨床データとの関連 (2016)
  • Author(s): 岩村 侑樹、林 潤一郎、佐藤 孝至、佐藤 聡太、村上 多恵子、藤村 岳樹、佐々木 康行、高橋 枝里、嶋﨑 義浩、三谷 章雄、福田 光男
  • Organizer: 第７回日本口臭学会学術大会
  • Place of Presentation: 愛知学院大学名城公園キャンパスキャッスルホール（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2016-06-19 – 2016-06-19
• [Presentation] 組織透過性を利用した半導体レーザーによるaPDTについて (2016)
  • Author(s): 佐々木康行, 林潤一郎, 岩村侑樹, 藤村岳樹, 大野祐, 岡田康佑, 相野誠, 西田英作, 山本弦太, 三谷章雄, 福田光男
  • Organizer: 第59回春季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: かごしま県民交流センター（鹿児島県鹿児島市）
  • Year and Date: 2016-05-20 – 2016-05-20
• [Presentation] 歯根形態異常が修飾因子と考えられた2壁性垂直性骨吸収に対し，歯周組織再生療法を行った一症例 (2016)
  • Author(s): 菱川敏光，菊池毅，三谷章雄
  • Organizer: 第59回春季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: かごしま県民交流センター（鹿児島県鹿児島市）
  • Year and Date: 2016-05-20 – 2016-05-20
• [Presentation] 関節リウマチを伴った広汎型重度慢性歯周炎の一症例 (2016)
  • Author(s): 小澤奈央，菊池 毅，青島郁美，山羽京子，大河内ひろみ，加藤万理，三谷章雄
  • Organizer: 第59回春季日本歯周病学会学術大会
  • Place of Presentation: かごしま県民交流センター（鹿児島県鹿児島市）
  • Year and Date: 2016-05-20 – 2016-05-20
• [Presentation] GIPによる歯周炎抑制経路の検討 (2016)
  • Author(s): 鈴木佑基、小林泰子、中村信久、宮部愛、西川徹、宮島真一、足立圭、水谷誠、菊池毅、宮澤健、月山克史、山田祐一郎、後藤滋巳、大野紀和、野口俊英、三谷章雄、松原達昭、成瀬桂子
  • Organizer: 第59回日本糖尿病学会年次学術集会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-05-19 – 2016-05-19
• [Book] 患者さんに語る シンプル歯周治療 (2016)
  • Author(s): 吉江弘正, 和泉雄一 編著／多部田康一, 高橋慶壮, 三谷章雄, 佐藤聡, 両角祐子, 三辺正人, 工藤値英子, 荒川真一, 中島啓介, 臼井通彦, 吉成伸伸夫, 石原裕一, 五味一博, 齋藤淳, 今村健太郎, 坂上竜資, 山本松男 ほか 著
  • Total Pages: 112 (16-19)
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Book] 言語聴覚士のための基礎知識 臨床歯科医学・口腔外科学 第２版 (2016)
  • Author(s): 夏目長門 編／三谷章雄，菊池毅 ほか 著
  • Total Pages: 328 (50-53)
  • Publisher: 医学書院