2018 Fiscal Year Annual Research Report
Fluorescent-based method for monitoring mast cell degranulation
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16K12730
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
東尾 浩典 岩手医科大学, 教養教育センター, 講師 (50342837)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋野 朝幸 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40305991)
吉田 潤 岩手医科大学, 教養教育センター, 助教 (20611007)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マスト細胞 / 即時型アレルギー / 調節性分泌 / 蛍光色素 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
花粉症などの即時型アレルギーは、マスト細胞の分泌顆粒中の化学伝達物質が開口放出されることが引き金となる。それゆえ脱顆粒を制御する物質の探索・同定は重要であり、本研究では脱顆粒制御物質の探索に資する新たな脱顆粒評価法の構築を、顕微鏡でのライブイメージング技術に着目して試みてきた。
前年度までに、分泌顆粒のpHをモニターできる、あるいは分泌顆粒の内容物と相互作用する各種蛍光色素に着目して脱顆粒イメージングへの利用可能性を検討してきたが、各蛍光色素に分泌刺激特異性・刺激応答性・蛍光強度いずれかの面での懸念があった。そこで本年度はさらに、脂質二重膜に相互作用する各種蛍光色素の利用可能性を検討し、1つのFM色素が上記の問題をほぼクリアすることを見出した。この色素を培地に添加して分泌刺激を与えると、抗原刺激・非抗原刺激どちらの添加時にも細胞内へ色素が侵入してそこで蛍光を発し続け、脱顆粒軌跡らしき形態を可視化した。その蛍光強度増大のタイムコースは従来のベータヘキソサミニダーゼの酵素活性を指標とした生化学的脱顆粒評価法と同様であった。さらに、脱顆粒関連遺伝子(Munc13-4やMunc18-2など)の発現抑制下では、色素の細胞内侵入と蛍光強度増大が顕著に制限された。また、一連の検証過程において、分泌刺激の種類によって脱顆粒様式が変化していることを示唆する結果も得られた。
この色素は、脱顆粒を起こした分泌顆粒の膜を可視化し続けていると考えられ、蛍光プレートリーダーを用いた脱顆粒度合の評価、加えて共焦点レーザー顕微鏡を用いた脱顆粒様式の解析に極めて有用であると判明した。
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