Development of Escherichia coli capable of producing antibody with humanized glycan structure

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K14886
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤山 和仁 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 教授 (70209112)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大橋 貴生 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 助教 (10597876)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 糖鎖 / 大腸菌 / 転移酵素

Outline of Annual Research Achievements

１．Campylobacter由来糖鎖転移酵素CjPglBの変異操作と機能改良；Campylobacter属細菌10種の糖鎖転移酵素PglBの一次構造および転移する糖鎖構造の多様性に関する報告（Nothaft et al, 2012）およびC. jejuni由来CjPglBのタンパク質三次構造(Maita et al, 2011)情報を活用し、糖鎖転移部位認識関連部位と、ヒト型糖鎖認識に対する親和性関連部位を推定し、改変対象アミノ酸残基を選抜した。候補変異pglBを、他の修飾酵素遺伝子を持つベクターに挿入した。H28年度転移活性を確認した糖鎖修飾検証用モデルタンパク質C. jejuni由来CmeAタンパク質を用いて、変異酵素PglBの転移活性を確認したが、その転移効率は低下した。
２．抗体など医療用モデルタンパク質の大腸菌ペリプラズム画分での生産系開発；抗体のH鎖、L鎖をコードする遺伝子を持つ発現ベクターを構築した。大腸菌のペリプラズム画分にて可溶性かつ活性型で生産させるためペリプラズム移行シグナルPelBを付加した。大腸菌でH鎖の発現を確認できたが、L鎖の発現は低かった。発現確認できたH鎖は可溶性タンパク質画分としての生産性は低かった。
３． Desulfovibrio gigas由来糖転移酵素DsPglに関して発表論文（Ollis et al, 2015）を元に実験を計画を改変した。これまで、当該論文では、全長型H鎖、L鎖を大腸菌で発現させて糖転移活性を調査するのではなく、Truncated型抗体を用いて転移活性を評価していたので、本研究でもモデル抗体タンパク質を発現が期待できるTruncated型に変更した。また、DsPglは、抗体が本来糖鎖修飾され認識配列を、低効率ながら認識するためDsPglを用いることにした。両遺伝子を構築し、発現バクターを作成に着手した。