2017 Fiscal Year Research-status Report
魚類病原体ゲノム情報を利用した網羅的エピトープマッピング
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16K14977
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| Research Institution | Fisheries Research and Education Agency |
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Principal Investigator |
高野 倫一 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主任研究員 (40533998)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マダイイリドウイルス / ファージディスプレイ / エピトープ / ワクチン / 魚病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
病原体の感染に耐過した魚の抗体が認識する成分(エピトープ)を同定できれば、組換え技術を利用した成分ワクチンの開発を効率化することができる。本研究では、効率的かつ網羅的なエピトープ同定技術の開発を目指す。具体的には、魚類病原体のゲノムDNA断片を無作為に挿入したファージディスプレイライブラリーを構築する。次いで、感染耐過魚などの抗体が結合するファージクローンを選抜し、挿入されている病原体由来DNA断片の塩基配列を決定する。決定した配列を病原体のゲノム配列情報に照合し、エピトープを推定する。
平成29年度は、マダイイリドウイルス(RSIV)のファージディスプレイライブラリー(RSIV-PDL)を使用し、抗RSIVモノクローナル抗体(M10)が認識するエピトープの同定を行った。M10を吸着したプロテインAビーズとRSIV-PDLを混合することで、M10が認識するファージクローンを濃縮した。ここから無作為に選択したいずれのクローンも、RSIVのlaminin EGF repeat including protein (LERIP)遺伝子の特定の領域を有していた。この領域がコードするアミノ酸配列を含んだ組換えタンパク質についてウエスタンブロット解析を行ったところ、LERIP中の特定の6アミノ酸残基がM10モノクロのエピトープであることを見つけた。M10はRSIV感染細胞表面に強く反応することが分かっている。養殖魚にLERIPに対する免疫を誘導することができれば、RSIV感染細胞の傷害が可能になると考えられる。すなわち、LERIPを利用した成分ワクチン開発に期待が持てる。
今回、マウスで作製したモノクローナル抗体のエピトープマッピングにRSIV-PDLが有用であることが分かった。RSIV感染耐過魚の抗体が認識するエピトープの同定にもRSIV-PDLが利用可能であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度は上述の通り、抗RSIVモノクローナル抗体(M10)のエピトープの同定を行うことで、作製したRSIV-PDLの有用性を確認した。さらに、魚類の抗体が認識するエピトープの同定を行うために、RSIV-PDLとRSIV感染耐過ブリ血清(n=3)を混合したのち、抗ブリIgMモノクローナル抗体を使用して血清中の抗体に結合するファージクローンを濃縮した。濃縮したファージからDNAを抽出し、RSIV由来のDNA断片をPCRによって増幅した。次いで、増幅したDNA断片について次世代シークエンスを行い、塩基配列情報（リード）を取得した。次年度は、取得したリードを病原体ゲノム配列上にマッピングし、エピトープをコードした領域を網羅的に推定する予定である。以上の内容はH29年度はじめに計画していた内容と一致し、計画通りに課題が進捗しているものと判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
RSIV感染耐過ブリの血中抗体で濃縮したファージクローンから取得した塩基配列情報 (リード)を、病原体の全ゲノム配列上にマッピングし、マッピングされたリードの重複回数の多い領域を整理する。同様の作業をRSIV感染にnaiveなブリの血中抗体に対しても行う。この両者のデータを比較し、RSIV感染耐過ブリでマッピングされたリードの重複回数が有意に多くなる領域をRSIVゲノム上に見つけ、エピトープをコードした領域の候補とする。この作業は複数の個体で行う。最後に、個体間で共通して認識されるエピトープを決定する。以上の解析から得られた情報は、本課題終了後の成分ワクチン開発において抗原を選定するための根拠にする。
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