CALHMチャネル機能を基盤とした感覚情報伝達機構の新規概念の構築

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15181
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 樽野 陽幸 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20706824)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加塩 麻紀子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20631394) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: イオンチャネル / 神経伝達 / 翻訳後修飾 / 味覚

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、近年発見されたCalcium Homeostasis Modulator (CALHM)チャネル機能を基盤とした感覚情報伝達機構を包括的に探索・解明することである。そのために、本研究ではin vivoにおけるCALHMチャネルの組織学的・生化学的・生理学的解析を高感度に可能にするマウスモデルの作成、および、これら新規ツールを用いたin vivo CALHMチャネル機能探索・解析を行う計画をしている。
本年度は、当初の計画通り二つのCALHMチャネルサブユニットCALHM1およびCALHM3に関する遺伝子改変マウスモデル（CALHM1-Cre-IRES-V5マウスおよびCALHM3-tdTomatoマウス）の作成に成功した。また、本研究で作成したCALHM1-Cre-IRES-V5マウスの味蕾組織においてCALHM1の生化学的検出に初めて成功し、CALHM1チャネルがin vivoにおいてS-パルミトイル化修飾を受けていることを明らかにした。
さらに、S-パルミトイル化修飾がCALHM1チャネルに及ぼす影響をin vitroの系で詳細に解析し、パルミトイル化部位の特定（Cys100, Cys207）、パルミトイル化酵素の同定（Dhhc3, 7, 20）、さらにはCALHM1チャネルのゲーティングおよび脂質ラフト局在がパルミトイル化によって制御されていることを明らかにした。本研究成果は神経伝達メディエータイオンチャネルの新規制御メカニズムを明らかにしたもので、現在論文投稿中である。
さらに、上記２つの遺伝子改変アリルの両方をもつダブルノックインCALHM1-Cre-IRES-V5;CALHM3-tdTomatoマウスの作出にも成功し、今後の研究の進展に必要な研究ツールが揃った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、CALHMチャネルサブユニットに関する遺伝子改変マウスモデル（CALHM1-Cre-IRES-V5マウス、CALHM3-tdTomatoマウス、および、CALHM1-Cre-IRES-V5;CALHM3-tdTomatoマウス）の作成に成功した。
さらには、そのうち一つのマウスを用いてCALHM1チャネルの翻訳後修飾の存在およびその役割を包括的に明らかにすることができた。この点は計画以上に順調に進展している部分である。
一方で、CALHM3-tdTomatoマウスにおいて、組織学的な解析が計画通りにいかない部分があり、この点は今後の改善が必要とされる。
以上の通り、予定以上に進展しているものと進展が遅れている部分があり、全体としてみると概ね順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

CALHMチャネルサブユニットに関する遺伝子改変マウスモデル（CALHM1-Cre-IRES-V5マウス、CALHM3-tdTomatoマウス、および、CALHM1-Cre-IRES-V5;CALHM3-tdTomatoマウス）の作出に成功したので、今後はこれらのマウスを用いて、CALHM1およびCALHM3が発現する組織を網羅的に解析し、また発現組織における機能解析を進めていく予定にしている。
ただ、CALHM3-tdTomatoマウスにおいて、遺伝子配列は設計通り改変できているが、CALHM3発現細胞におけるtdTomatoの発現が極めて弱く、想定通りの組織学的解析ができない現状である。したがって、増感法などを駆使してCALHM3発現組織の解析の感度を上げる工夫を凝らしていく必要があると考えている。

Research Products

• [Journal Article] Adeno-associated virus-mediated gene transfer into taste cells in vivo. (2017)
  • Author(s): Taruno, A., Kashio, M., Sun, H., Kobayashi, K., Sano, H., Nambu, A., Marunaka, Y.
  • Journal Title: Chemical Senses Volume: 42 Pages: 69-78
  • DOI: 10.1093/chemse/bjw101
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hypotonicity activates a voltage-dependent membrane conductance in N2a neuroblastoma cells. (2017)
  • Author(s): Taruno, A., Marunaka, Y.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 482 Pages: 331-335
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.01.118
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Analysis of aprotinin, a protease inhibitor, action on the trafficking of epithelial Na+ channels (ENaC) in renal epithelial cells using a mathematical model. (2017)
  • Author(s): Sasamoto, K., Marunaka, R., Niisato, N., Sun, H., Taruno, A., Pezzotti, G., Yamamoto, T., Kanamura, N., Zhu, W., Nishio, K., Inui, T., Eaton, D.C., Marunaka, Y.
  • Journal Title: Cellular Physiology and Biochemistry Volume: 41 Pages: 1865-1880
  • DOI: 10.1159/000471934
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Actions of quercetin, a polyphenol, on blood pressure. (2017)
  • Author(s): Marunaka, Y., Marunaka, R., Sun, H., Yamamoto, T., Kanamura, N., Inui, T., Taruno, A.
  • Journal Title: Molecules Volume: 22 Pages: pii: E209
  • DOI: 10.3390/molecules22020209
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Neurotransmission of taste mediated by calcium homeostasis modulator ion channels. (2017)
  • Author(s): 樽野陽幸, 丸中良典
  • Organizer: 第94回日本生理学会大会.
  • Place of Presentation: 浜松（アクトシティ浜松）
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
• [Presentation] Palmitoylation regulates gating and lipid raft association of CALHM1 channel. (2017)
  • Author(s): 孫紅キン, 樽野陽幸, 中條浩一, 小野富三人, 丸中良典
  • Organizer: 第94回日本生理学会大会.
  • Place of Presentation: 浜松（アクトシティ浜松）
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
• [Presentation] Molecular basis of polarized sorting of CALHM channels in epithelial cells. (2017)
  • Author(s): 加塩麻紀子, 樽野陽幸, 丸中良典
  • Organizer: 第94回日本生理学会大会.
  • Place of Presentation: 浜松（アクトシティ浜松）
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
• [Presentation] Current-direction/amplitude-dependent single channel gating kinetics of Pannexin 1 channel. (2017)
  • Author(s): 白石真土, 野村健, 樽野陽幸, 丸中良典
  • Organizer: 第94回日本生理学会大会.
  • Place of Presentation: 浜松（アクトシティ浜松）
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
• [Presentation] Induction of foreign genes in taste cells in vivo. (2016)
  • Author(s): Taruno, A.
  • Organizer: The 15th international symposium on molecular and neural mechanisms of taste and olfactory perception.
  • Place of Presentation: 福岡（九州大学）
  • Year and Date: 2016-12-03 – 2016-12-04
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular machinery for taste neurotransmission from the tongue to the brain. (2016)
  • Author(s): Taruno, A.
  • Organizer: the 2nd UK-Japan Frontiers of Science Symposium.
  • Place of Presentation: UK
  • Year and Date: 2016-11-07 – 2016-11-09
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Homologous CALHM subunits assemble to form a novel voltage-gated ATP channel. (2016)
  • Author(s): Taruno A, Miyazaki H, Niisato N, Sun H, Kashio M, Marunaka Y.
  • Organizer: 第39回日本神経科学会大会.
  • Place of Presentation: 横浜（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-07-20 – 2016-07-22
• [Presentation] Purinergic neurotransmission of taste by CALHM channel. (2016)
  • Author(s): Taruno A, Marunaka Y.
  • Organizer: 17th International Symposium on Olfaction and Taste.
  • Place of Presentation: 横浜（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-06-05 – 2016-06-09
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Regulation of CALHM1 channel by protein S-palmitoylation. (2016)
  • Author(s): Taruno A, Hongxin Sun, Makiko Kashio, Marunaka Y.
  • Organizer: 17th International Symposium on Olfaction and Taste.
  • Place of Presentation: 横浜（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-06-05 – 2016-06-09
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] S－パルミトイル化修飾によるCALHM1チャネル機能制御. (2016)
  • Author(s): Taruno A, Sun H, Kashio M, Marunaka Y.
  • Organizer: 日本膜学会第３９年会.
  • Place of Presentation: 東京（早稲田大学）
  • Year and Date: 2016-05-10
• [Remarks] 京都府立医科大学細胞生理学website
  • URL: http://kpum-molecular-cell-physiology.info