2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒストンアセチル化とメチル化のクロストークを担う転写コレギュレーターの研究
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16K15216
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
西 英一郎 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (30362528)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 転写コレギュレーター / ヒストン修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メタロペプチダーゼ、ナルディライジン（NRDC）は、細胞内局在に依存して異なる機能（細胞外―膜タンパク質細胞外ドメインシェディング活性化、核内―転写調節、細胞質―ペプチダーゼ）を有する多機能タンパク質である。本研究ではヒストンアセチル化・メチル化のクロストーク制御におけるNRDCの役割、特にその酵素活性の役割を明らかにすることを目的とし、以下の研究を進めることを予定している。①NRDC欠損MEF に野生型、不活性型NRDCを再導入した細胞でChIP-seq、RNA-seqを行い、転写開始点周辺にNRDCが結合し、NRDC欠損で発現変動する遺伝子、さらに酵素活性依存性に発現変動する遺伝子を同定する。②同定したNRDC標的遺伝子におけるヒストンアセチル化およびメチル化変動を解析する。③ヒストンアセチル化・メチル化修飾酵素とNRDCの機能的連関を解析する。④NRDCペプチダーゼ活性の意義、特にヒストン修飾における意義をin vivoで検討するため不活性型NRDCノックインマウスを作製する。
当該年度においては、①NRDC欠損MEF に野生型NRDCを再導入した細胞を用いてNRDC抗体によるChIP-seqおよびRNA-seqを行い、転写開始点周辺にNRDCが結合し、NRDC欠損で発現変動する遺伝子（NRDC標的遺伝子）を同定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
NRDC標的遺伝子の同定：野生型MEF（MEF+/+）、NRDC欠損MEF（MEF-/-）を用いて予備的なChIPシーケンス（ChIP-seq）を行い、我々が作製した抗NRDC抗体のうち少なくともひとつのモノクローナル抗体は良好にワークすることを確認した。さらにMEF-/-に野生型NRDCを再導入したMEF（MEF-/-*WT）を加えて、ChIP-seq、RNA-seqを行い、転写開始点周辺にNRDCが結合し、NRDC欠損によって発現変動する遺伝子群をNRDC標的遺伝子として同定した。
以上の結果は、本研究を進める上で最も基本的なデータであり、最低限の進捗は得られたものの、研究室の移転（京都大学から滋賀医科大学）に伴い、一次的に研究はストップしており、本研究の進行はやや遅れていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
① NRDC欠損によるヒストンアセチル化およびメチル化変動の解析：MEF+/+、MEF-/-、MEF-/-*WTを用いてH3K4me2, H3K9AcのChIP-seqを行い、MEF-/-で認められた変化がMEF-/-*WTでレスキューできているかどうかを確認している。特に前年度に同定したNRDC標的遺伝子における変化を詳細に検討中である。
②NRDCは活性中心（HXXEH:亜鉛結合部位）のグルタミン酸に変異を導入することでペプチダーゼ活性を失う。MEF-/-に不活性型変異体NRDC*E>Aを再導入したMEFを用いて、前年度および①で行った解析を行い、MEF-/-*WTとの比較により酵素活性依存性標的遺伝子を同定する。さらにH3K9Ac, H3K4me2でChIP-seqを行い、NRDCの酵素活性がヒストンアセチル化、メチル化に及ぼす影響を検討する。NRDCの酵素活性依存性にヒストン修飾が変化した遺伝子を同定し、同プロモーター上におけるアセチル化、メチル化修飾酵素などの挙動をChIP-PCRなどを用いて明らかにする。
一方、現在ペプチダーゼ不活性型NRDCノックインマウス（E>A KIマウス）を作製中である。同マウスの表現型をNRDC欠損（KO）マウスと比較することで、個体レベルにおけるペプチダーゼ活性の役割を明らかにしたい。
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| Causes of Carryover |
京都大学から滋賀医科大学への異動に伴い、予定していた実験の一部を次年度に延期する必要が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度には、主として1) 各種遺伝子操作を加えたMEF細胞の培養、2) それらの細胞を用いて行うChIPシーケンス、RNAシーケンス施行に必要な次世代シーケンサー使用、3) ペプチダーゼ不活性型NRDCノックインマウスの作製、のために経費を使用する。
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[Journal Article] Loss of Nardilysin, a mitochondrial co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, promotes mTORC1 activation and neurodegeneration2017
Author(s)
Yoon WH, Sandoval H, Nagarkar-Jaiswal S, Jaiswal M, Yamamoto S, Haelterman NA, Putluri N, Putluri V, Sreekumar A, Tos T, Aksoy A, Donti T, Graham BH, Ohno M, Nishi E, Hunter J, Muzny DM, Carmichael J, Shen J, Arboleda VA, Nelson SF, Michael F. Wangler MF, Karaca E, Lupski JR, and Bellen HJ
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Journal Title
Neuron
Volume: 93
Pages: 115-131
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Nardilysin promotes hepatocellular carcinoma through activation of signal transducer and activator of transcription 32017
Author(s)
Kasai Y, Toriguchi K, *Hatano E, Nishi K, Ohno M, Yoh T, Fukuyaman K, Nishio T, Okuno M, Iwaisako K, Seo S, Taura K, Kurokawa M, Kunichika M, Uemoto S, *Nishi E
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Journal Title
Cancer Sci.
Volume: 108
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Nardilysin is Required for maintaining Pancreatic β-Cell Function2016
Author(s)
Nishi K, Sato Y, Ohno M, Hiraoka Y, Saijo S, Sakamoto J, Chen PM, Morita Y, Matsuda S, Iwasaki K, Sugizaki K, Harada N, Mukumoto Y, Kiyonari H, Furuyama K, Kawaguchi Y, Uemoto S, Kita T, Inagaki N, Kimura T and *Nishi E
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Journal Title
Diabetes
Volume: 65
Pages: 3015-27
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Nardilysin is a Promising Biomarker for the Early Diagnosis of Acute Coronary Syndrome.2016
Author(s)
Ohno M, Chen P-M, Hiwasa T, Nishi K, Saijo S, Sakamoto J, Morita Y, Watanabe S, Kuwabara Y, Ono K, Imai M, Inoue K, Murai T, Kita T, Kimura T, and Nishi E.
Organizer
American Heart Association Scientific Session
Place of Presentation
New Orleans, LA
Year and Date
2016-11-12 – 2016-11-16
Int'l Joint Research
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[Presentation] Nardilysin, a novel biomarker for hepatocellular carcinoma, enhances diethylnitrosamine-induced mice carcinogenesis and cancer cell proliferation via activation of STAT3 signaling pathway2016
Author(s)
Kasai Y, Hatano E, Nishi E, Toriguchi K, Yoh T, Nishio T, Okuno M, Seo S, Taura K, Yasuchika K, Okajima H, Kaido T, Uemoto S
Organizer
International Liver Cancer Association 2016
Place of Presentation
Vancouber
Year and Date
2016-09-09 – 2016-09-11
Int'l Joint Research
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