2016 Fiscal Year Research-status Report
顎顔面口腔疾患iPS細胞における病原変異遺伝子の人工ヌクレアーゼによるゲノム手術
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16K15823
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
岡本 哲治 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 教授 (00169153)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
濱田 充子 広島大学, 病院(歯), 歯科診療医 (30760318)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 無血清培養 / フィーダー細胞フリー培養 / 口腔顎顔面遺伝性疾患 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / ゲノム手術 / 病原変異遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、口腔顎顔面遺伝性疾患患者由来体細胞の初代培養及び初期化の全プロセスを、宿主染色体に遺伝子挿入がないセンダイウイルスベクター(SeVdp)及び当科で開発した完全無血清・フィーダーフリーの培養系を用いて行い、各種疾患特異的iPSCの樹立・長期維持に成功し、報告してきた。現在までに、基底細胞母斑症候群、Cowden症候群、鎖骨頭蓋異形成症(CCD) (Runx2, aa.R225Q)やヌーナン症候群(NS)、特異的iPS細胞を樹立してきた。特に、鎖骨頭蓋異形成症(CCD) (Runx2, aa.R225Q)やヌーナン症候群(NS) (Kras, aa.D153V)患者由来iPSCsにおいては、SCIDマウスでのテラトーマ組織における軟骨組織は、健常人iPSC由来のそれと比較し、細胞が膨化し軟骨基質が疎な患者の疾患病態を反映した組織像を示したことから、これら疾患特異的iPSCの機能解析にin vivoでのテラトーマ形成法が有用であることを示した。。今回、これらiPSCsを用いて、in vitroでの無血清培養系を用いた細胞増殖シグナル及び軟骨分化誘導解析を行い、その機能解析を行うことで疾患研究への有用性を検討した。その結果、RASの活性化率をpull down assay法及びWB法にて検討したところ、健常人iPSCと比較してNS-iPSCではRASの恒常的活性化を認めたことから、NS-iPSCではKras遺伝子の変異に基づくRASの機能亢進が生じていることが明らかとなった。また、無血清3次元培養系を用いてCCD-iPSC及びNS-iPSCから軟骨細胞への分化誘導を行ったところ、テラトーマと同様の疎な軟骨基質からなる軟骨組織を形成した。
これら疾患特異的iPSCsは、疾患病態の一部をin vitro及びin vivoで再現可能であることが示された。血清や未知の成分、フィーダー細胞などの不確定要素を完全に排除した、再現性の高い本iPSC誘導・培養系は、疾患モデルの確立に有用であることが示され、各種疾患の分子・細胞レベルでの病態解明及び治療法開発への応用が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各種疾患由来iPS細胞はin vitro及びin vivoにおいて疾患のphenotyoeを反映していることを明らかにしたことから、
今後、そのphenotypeを指標にゲノム手術の効果を評価するアッセイ系が確立できたことから。
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| Strategy for Future Research Activity |
完全無血清培養系でのiPSC誘導・培養系は、再現性が高く、疾患モデルの確立や各種疾患の分子・細胞レベルでの病態解明及び治療法開発への応用が期待される。
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| Causes of Carryover |
CRISPR/Cas9によるゲノム編集関係の試薬購入が次年度になったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度よりCRISPR/Cas9によるゲノム編集実験を開始するので、支障なく執行できる。
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[Journal Article] Generation and maintenance of human induced pluripotent stem cells in serum-free and feeder-free culture condition-comparison of various target cells and virus vectors2016
Author(s)
E. Akagi, S. Yamasaki, A. Hamada, H. Nakatao, F. Obayashi, T. Yasui, Y. Taguchi, M. Ohtaka, K. Nishimura, M. Nakanishi, T. Okamoto
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Journal Title
Jpn. J. Tissue Cult. Soc. Dent. Res
Volume: 25(1),
Pages: 21-22
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[Journal Article] Generation of Disease-specific human iPSCs in integration-, feeder-, and serum-free culture2016
Author(s)
A. Hamada, H. Nakatao, F. Obayashi, T. Yasui, E. Akagi, S. Yamasaki, S. Toratani, T. Okamoto
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Journal Title
Jpn. J. Tissue Cult. Soc. Dent. Res
Volume: 25(1),
Pages: 23-24
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[Presentation] Generation of disease-specific human induced pluripotent stem (iPS) cells from dental pulp cells of a patient with Cleidocranial dysplasia in serum-, and feeder-free culture2016
Author(s)
A. Hamada, S. Yamasaki, E. Akagi, H. Nakatao, F. Obayashi, T. Fukutani, K. Koizumi, T. Hamana, T. Okamoto
Organizer
The 14th International Conference on cellular endocrinology
Place of Presentation
Hiroshima, Japan
Year and Date
2016-11-13
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[Presentation] Establishment and characterization of normal and disease-specific human iPSCs in serum-, integration- and feeder-free culture, Plenary Symposium on Infinite Potential of Stem Cells,2016
Author(s)
S. Yamasaki, A. Hamada, H. Nakatao, E. Akagi, F. Ohbayashi, T. Fukutani, S. Toratani, T. Okamoto
Organizer
2016 World Congress on In Vitro Biology
Place of Presentation
San Diego, California, USA
Year and Date
2016-06-14
Int'l Joint Research / Invited
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