2017 Fiscal Year Research-status Report
睡眠誘発物質合成酵素L-PGDSの基質認識と生成物放出のメカニズムの解明
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16K18868
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
島本 茂 近畿大学, 理工学部, 講師 (00610487)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | プロスタグランジンD2 / 等温滴定型熱測定 / 核磁気共鳴法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、睡眠誘発物質であるPGD2の合成と輸送を担うL-PGDSの酵素反応および生成物放出のメカニズム解明を目的としている。H28年度までの研究で、様々な基質および生成物の類似化合物の相互作用情報を得た。さらに、L-PGDSのNMR測定を行い、主鎖アミドプロトンのケミカルシフトの帰属をほぼ完了した。
H29年度は、主に以下の2つの情報を得た。1)基質および生成物の類似化合物のNMR滴下実験を行い、L-PGDSにおけるそれぞれの化合物の結合部位を同定した。2)変異体を用いた基質および生成物の類似化合物とのITC相互作用解析により、結合に重要なアミノ酸残基の情報を得た。
1)に関しては、プロスタグランジンの9位のOH基と15位のOH基の有無によって二つの結合部位(site-1およびsite-2)への結合様式が異なるという結果が得られた。さらに、2)の実験では、L-PGDSのΩ-loop領域およびEF,GH-loop領域のアミノ酸は酵素活性部位から離れているにも関わらず、その変異によって基質類似化合物への親和性が大きく低下した。
一方で、H29年度より始めたL-PGDSと基質および生成物の類似化合物との複合体のX線結晶構造解析では、構造解析に十分な結晶とデータを得ることができなかった。L-PGDSのみの結晶化の最適化を行い、かなり高濃度のL-PGDSの条件でないと結晶化しないこと、また、リガンドが存在する(結合する)条件下では凝集沈殿しやすいことがわかった。それらの問題点を解決するためにさらなる条件検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度に計画していた実験、1)L-PGDSの変異体の作製とそれを利用したITC相互作用解析による結合に重要なアミノ酸の同定、2)NMRリガンド滴下実験による基質および生成物の類似化合物の結合部位の同定、3)L-PGDSと基質および生成物の複合体のX線結晶構造解析のうち、1),2)に関しては概ね予定通り完了した。しかし、3)に関しては良好な結晶化条件が見つかっておらず、十分に進展しているとは言えない。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)L-PGDSの変異体作製―結合Site-2における認識に重要なアミノ酸を特定するため、さらなる変異体の作製とその相互作用解析を行っていく。
2)NMRによるL-PGDS/PGD2複合体の構造解析―すでに主鎖のアミドプロトンの帰属が完了しているので、今後は側鎖の帰属を行っていく。
3)L-PGDSのX線結晶構造解析―現段階で遊離型のL-PGDSの結晶化には成功しており、L-PGDSの濃度条件を決定することができている。しかし、複合体形成の条件でL-PGDSの凝集性が見られるため、凝集抑制剤の検討やさらなるスクリーニングを行う。また、リガンドの違いによる結晶化条件の変化も観察されているため、生成物の類似化合物との複合体も検討していく。
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| Causes of Carryover |
平成30年2月末(平成29年度)にあった国際生物物理学会に参加した際の海外出張旅費の申請が、年度内の申請締切に間に合わなかったため、次年度予算より支出することになった。その費用分だけ、次年度使用額が生じた。
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Research Products
(2 results)
