2016 Fiscal Year Research-status Report
ＥＲＭタンパク質リン酸化状態およびトランスポーター機能に対する炎症因子の影響
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16K18966
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
川瀬 篤史 近畿大学, 薬学部, 講師 (80411578)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | トランスポーター / 炎症 / リン酸化 / 裏打ちタンパク質 / サイトカイン / 肝細胞 / radixin / MRP2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
薬物の体内動態制御因子のひとつである薬物輸送担体（トランスポーター）の細胞膜での安定発現・機能に細胞骨格タンパク質であるERMタンパク質が重要な働きをしている。特に，肝臓の胆管側膜に局在するMRP2やP-糖タンパク質に対するERMタンパク質の一種であるradixinの役割については種々の報告がなされている。ERMはリン酸化を伴い活性しトランスポーターとアクチン間でのリンカー機能を発揮する。炎症は種々の病態の発生および進行に関わっており，炎症時のERMタンパク質活性化およびトランスポーター機能変動を明らかにすることは薬物治療上重要であると考えられる。そこで，炎症時の薬物動態におけるERMタンパク質の重要性について考察し，創薬ターゲットとしてのERMタンパク質の可能性を評価した。
炎症モデルとしてアジュバント関節炎 (AA)ラットを用い，ERMタンパク質リン酸化状態，トランスポーター発現およびERMタンパク質-トランスポーター複合体の定量法の確立を行った。対象となるタンパク質をトリプシン消化した際に生成するペプチド断片の候補のうち，定量に適する配列を決定した。リン酸化ERMタンパク質の検討では，Phos-tag含有アクリルアミドゲルを用いSDS-PAGE，ウエスタンブロッティングを行うことで検出することが可能となった。
確立したリン酸化ERMタンパク質，トランスポーター発現およびERMタンパク質-トランスポーター複合体の測定条件を用い，HepG2細胞に炎症性サイトカイン処理時のERMタンパク質およびトランスポーター変動について検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していたラット肝臓におけるERMタンパク質リン酸化状態，トランスポーター発現およびERMタンパク質-トランスポーター複合体の定量法の確立が完了し，AAラットおよび炎症因子処理細胞における発現量の測定の実施までが完了したため。当初，リン酸化ERMタンパク質の測定はペプチド濃縮を行ったサンプルで行うことを予定していたが，目的のペプチドが十分な感度で得られないためPhos-tag含有SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング法により行うこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
炎症因子処理は平成28年度と同様に行い，ERMタンパク質を細胞にて過剰発現およびノックダウンさせた時のグルタチオンレベル，PKA/PKCバランス変動がERMタンパク質リン酸化状態に与える影響について検討を行う。ノックダウンについてはターゲットに対する複数のsiRNAのうち最もノックダウン効率が高いものを用い，トランスポーター発現および機能に対する影響を検討する。得られた結果に応じて，肝臓以外の小腸や腎臓についても同様の検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
当初購入を予定していた物品のうち，HepaRG細胞を用いず研究室に所有しているHepG2細胞を用い予備的に検討を実施し，Titansphere Phos-TiO Tipが本試験に入る前に目的のペプチド検出を行うのに適していないと判断された。また，次年度にMemPER Plus Membrane Protein Extraction Kitを支出する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ペプチドの分析カラムの購入および細胞培養関連物品およびMemPER Plus Membrane Protein Extraction Kitが該当年度に必要となり支出する予定である。これらの理由より次年度使用額が生じ
，これらの予算は実験計画に従い消耗品の購入費として用いる。
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