2017 Fiscal Year Research-status Report

細菌由来RNAによる抗菌薬の早期効果判定法確立および薬剤選択法の構築

Research Project

Project/Area Number	16K20950
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	八島秀明群馬大学, 医学部附属病院, 助教 (60773512)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	感染症 / 抗菌薬 / 効果判定 / RNA / マーカー / 細菌
Outline of Annual Research Achievements	本研究ではpre-rRNAという細菌の増殖速度によって変動する核酸をマーカーとして利用し、迅速な抗菌薬の効果判定法を確立することで、感染症治療における最適な薬剤選択法および薬物療法設計法の構築を行うことが目的である。 Pre-rRNAは細菌の細胞増殖の際に合成されるribosomal RNAの前駆体であるため、生菌が増殖すると上昇するが、菌が死滅しRNA合成が止まると、pre-rRNAの合成は止まり、RNaseにより成熟のribosomal RNAとなるため、中間体であるpre-rRNAは減少する。抗菌薬により細菌が死滅した場合も同様の現象がみられると考えられる。これまでに、抗菌薬を曝露しない条件において、緑膿菌PAO-1株の細菌増殖とpre-rRNAの関係について詳細に検討を行った。その結果、細菌増殖とより関連が強いものは一細菌あたりのpre-rRNA値であることが示唆された。次に、各種抗生物質（βラクタム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系）を緑膿菌PAO-1株に対して曝露した際の、生菌数の変化と細菌から抽出したpre-rRNAの関係性の解析を行った。具体的には抗菌薬の濃度条件を変化させて、抗菌薬曝露後に継時的にサンプリングを行った。一細菌あたりのpre-rRNA値は、抗菌薬非曝露群では細菌増殖2～3時間後に最大値を示したことから、我々はこの3時間値をマーカーとして使用し、緑膿菌PAO-1株に対するメロペネムの曝露実験では、その上昇が抑制されることを見出した。この差異を測定することで、感染症サンプル中の起因菌の抗菌薬感受性は判定可能となった。一方でメロペネム以外にシプロフロキサシンとトブラマイシンを用いた検討を行った結果、pre-rRNAのプロファイルに薬剤間の違いがあることが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 抗菌薬曝露時のpre-rRNAの変化が抗生物質の系統ごとに（βラクタム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系）異なることから、一律のモデル式で表すことができないことが示唆され研究計画に比較して多少遅れが生じている。数理生物学的に考え得るモデル式を検討し、現在までに得られたpre-rRNAのデータでフィッティングするか検討したところ、正確にpre-rRNA値の変化を表すモデル式を構築ができていない。
Strategy for Future Research Activity	現在まで得られたデータから、pre-rRNAのプロファイルは①殺菌的作用を有する抗菌薬、②静菌的作用を有する抗菌薬、③pre-rRNAの合成を直接阻害する抗菌薬の3つの異なるグループに分けられると推測している。最も少ない変数にてモデル化可能と推測された「③pre-rRNAの合成を直接阻害する抗菌薬」についても現在までにモデル化には至っていない。リアルタイムPCRにて検討を行ってきたが、より正確かつ感度の高いデジタルPCRを用いた測定に変更し、引き続きモデル化についても検討を行っていく予定である。また、計画が遅延した場合の対処法として考慮していたプロテオーム解析を用いた方法についても並行して検討を開始する。抗菌薬により殺菌されると経時的に変化するペプチドマーカーを調査する。当研究室ではプロテオーム解析の手法は確立しており、細菌中のタンパク質の効率の良い抽出法が確立すれば検討が可能である。pre-rRNAの代わりに効果判定が可能なタンパク質を同定できれば、そのあとのプロセスは計画書通りにモデル化を行く予定である。
Causes of Carryover	当初の予定では動物モデルでの核酸の検討など高額な専用キットの使用が必要な実験を多く行う予定であったが、数式モデル構築のためのデータ解析やプロテオーム解析の検討など想定していたよりも安価な支出での検討を行うことが多くなったため次年度使用額が生じた。次年度については、pre-rRNAの検出精度を上げるデジタルPCRでの検討やプロテオーム解析についても多くのサンプルで実施予定となるため、繰り越した額についても実験に必要と考えられる。