2017 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of mechanisms of regeneration-bud formation in the cricket using novel genetic engineering method
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16K21199
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| Research Institution | Tokushima Agriculture, Forestry, and Fisheries Technology Support Center |
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Principal Investigator |
渡辺 崇人 徳島県立農林水産総合技術支援センター(試験研究部), 徳島県立農林水産総合技術支援センター(資源環境研究課), 研究員 (30709481)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / ノックイン / RNA-seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究においては，コオロギをモデル生物としてノックアウト作製技術に加えて，ノックイン技術や新たにコンディショナルノックアウト作製技術を開発し，複合的に駆使することにより世界に先駆けて昆虫の脚再生メカニズムを解明することを目的とした。まず，コンディショナルノックアウト系統を作製するために, CRISPR/Cas9システムによるノックイン技術とpiggyBacのような転移酵素を組み合わせて使用する方法を考案した。これまでに，piggyBacのコンポーネントが組み込まれたノックインベクターを作製し，intronへのノックインを試みたが，ノックインベクターが組み込まれる方向を制御することができないことが原因で，正確な方向でノックインされた系統は得られなかった。そこで，ノックインの方向及び結合部位を正確に組み込む方法として，MMEJの経路を用いたノックイン技術の導入を試み，標的遺伝子の終止コドン上にMMEJによるノックインによって，eGFP遺伝子を正確に組み込み，その発現を観察することに成功した。また，手順の簡略化及び高効率化を目指し，Cas9タンパク質によるゲノム編集の確立を行ったところ，効率がmRNAとほぼ同等の条件を明らかにし，手順を大幅に簡略化することに成功した。
また，標的遺伝子の絞り込みのために，次世代シークエンサーPacBioRSIIを用いたRNA-seq解析を行った。抽出したmRNAを１－２kb，２－３kb，３－６kb，５－１０kbに分画し，それぞれ４cellずつシークエンス解析を行った。その結果，合計で７６万リード，２．２５Gbの配列を得ることができた。本シークエンスをゲノム情報にマッピングし，解析を進めている。
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