2007 Fiscal Year Annual Research Report
ナノパーティクルを用いた高次機能性複合体の細胞内再構成とモデル細胞系への応用
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17076008
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
吉村 成弘 Kyoto University, 生命科学研究科, 准教授 (90346106)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日詰 光治 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (10378846)
竹安 邦夫 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (40135695)
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| Keywords | ナノパーティクル / 量子ドット / 核輸送 / 試験管内タンパク質合成 / レーザトラップ / 1分子測定 |
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| Research Abstract |
(1)ナノパーティクルの核内への輸送技術の確立
細胞核内へタンパク質等の高分子を輸送するには、分裂間期に核膜上にある核膜孔複合体を介して能動輸送する場合と、分裂期に核膜が一度崩壊して再構築される際にランダムに核内に取り込まれる場合とがある。核膜孔複合体を介した物質輸送には、インポーティンと呼ばれる一連のタンパク質群により媒介される経路が主要な役割を果たしている。ここではこの経路を利用して、核膜を崩壊させることなくナノパーティクルを核内に輸送する技術を確立した。まず、アミノ末端をビオチン化した核移行シグナルペプチドをストレプトアビジンを結合させた量子ドットに結合させる。これをインポーティンα、β、RanGDP、NTF2などのタンパク質と共にジギトニン処理したHeLa細胞に加え、量子ドットの動きを蛍光顕微鏡で観察すると、核内にいくつかの量子ドットが観察された。これは、インポーティンβを加えなかった場合には見ることができなかった。また、この量子ドットを生細胞の細胞質にマイクロインジェクションする技術を確立し,生きた細胞の核内へナノパーティクルを輸送する技術を確立した。
(2)リボソームによるタンパク質合成機構の1分子解析
In vitroのタンパク質合成系は人工細胞を構築する上で必須の技術である。ここでは、マイクロパーティクルとレーザートラップ技術とを組み合わせ、リボソームによるタンパク質合成の反応機構を解析した。ヘアピン構造をとるメッセンジャーRNAの両端をラテックスビーズ(直径5 um)に結合させ、一方をガラスピペットに固定し、もう一方をレーザートラップで補足し、リボソームがタンパク質を合成する際にヘアピン構造を開裂させる様子を追った。この結果、リボソームは停止と移動とを繰り返しながら、3塩基ずつのステップで進行してゆくことが明らかになった。
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