2018 Fiscal Year Annual Research Report
Omics reveals nitrogen cycling system with anammox
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17H00793
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| Research Institution | Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology |
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Principal Investigator |
高見 英人 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海底資源研究開発センター, 上席研究員 (70359165)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒岩 恵 中央大学, 理工学部, 助教 (00761024)
諏訪 裕一 中央大学, 理工学部, 教授 (90154632)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | anammox / 窒素循環 / ゲノム解析 / メタゲノム解析 / 安定同位体解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
anammox活性や脱窒活性を示す集積培養系には、anammox細菌の他に亜硝酸酸化細菌、脱窒反応の一部を担うと思われる2種の不完全型脱窒菌が優占種として存在し、相互補完的な窒素代謝によって生態系を維持していると予測される。この4種の主要バクテリアのゲノム再構築を行い、新学術領域ゲノム支援によって亜硝酸酸化細菌のゲノム全解読に成功している。一方、完成したはずのanammox細菌、Ca. Brocadia purgamentorumと不完全脱窒菌Betaproteobacteria細菌のゲノムには分断された遺伝子や明らかな欠損と思われる遺伝子群が存在したため、ゲノム全解読に必要なCa. B. purgamentorum、およびBetaproteobacteria細菌由来のゲノムDNAを菌体破砕条件の違いからそれぞれ濃縮する方法の検討を昨年度に引き続き行った。濃縮されたDNAの配列決定を行い、既存配列とのアセンブルの結果、Ca. B. purgamentorumおよびBetaproteobacteria細菌のゲノム配列の問題が解決され、anammox細菌としてはCa. Kuenenia stuttgaritiensisに次ぐ2例目の全ゲノム解読が終了した。また、Betaproteobacteria細菌ゲノムの全解読も終了した。これにより、anammox集積培養系の4優占種のうち3種のゲノムが全解読、残る不完全脱窒菌の1つであるChloroflexi門のAnaerolineae科細菌のゲノム配列も約90%の領域をカバーする2つのゲノム断片にまで再構築された。
一方、既に確認した15NOを基質として用いたanammox反応による窒素ガス検出実験に加え、anammox反応の中間産物である15NH2OH(ヒドロキシルアミン)を用いた場合の窒素ガスの検出も確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新学術領域ゲノム支援事業によって完成したと思われたCa. B. purgamentorumおよびBetaproteobacteria細菌のゲノム中に矛盾する領域や精度的な問題点が見つかったため、これらのゲノムがそれぞれに濃縮されるゲノムDNAの抽出法を2018年度も検討し、ゲノム再構築に必要となるDNAをそれぞれ十数マイクログラム取得し、配列決定を行った。この新規に決定した配列と以前に決定したメタゲノム配列をアセンブルし、他のCa. Brocadiaゲノム情報も利用してゲノム再構築を行った結果、これまでの矛盾点が解決されCa. B. purgamentorumゲノムの全解読に成功した。anammox菌ゲノムとしては、Ca. Kuenenia stuttgaritiensisに次ぐ2例目である。また、不完全脱窒菌のBetaproteobacteria細菌ゲノムについても、精度的に問題があった複数の遺伝子の問題が新規に取得した配列情報によって解決し、ゲノムの全解読に至った。残るChloroflexi門Anaerolineae科細菌のゲノムについては、同科の全く異なる2種類の細菌ゲノム断片が検出されているため、現在約90%にまで再構築されているゲノムの完全解読は困難と考え、メタゲノム配列からのゲノム解読は終了とした。
一方、2017年度Ca. B. purgamentorumは基質としてNOを利用できることが予備実験によって示唆されたが、2018年度15NOを基質として用いた再現実験を行い、その再現性を確認した。また、NO以外の基質として、anammox反応の中間産物である15NH2OH (ヒドロキシルアミン)を用いた実験においても29N2ガスの生成が確認され、Ca. B. Purgamentorumはヒドロキシルアミンも基質として利用可能であることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ca. B. purgamentorumと不完全脱窒菌Betaproteobacteria細菌のゲノムが全解読されたことから2019年度は、まず全解読した3細菌(anammox細菌、亜硝酸酸化細菌、不完全脱窒菌)と不完全ながら約90%のゲノム領域をカバーする他の不完全脱窒菌細菌をリファレンスゲノムとして既に得たメタトランスクリプトーム配列をマッピングし、各ゲノム中のribosome蛋白質の平均RPKM値と各窒素代謝反応に関与する遺伝子のRPKM値との比に基づき発現プロファイルを作成する。これにより、各生物種由来の窒素代謝反応関連遺伝子の発現パターンを整理し、複合培養系の窒素代謝モデルを構築する。また、ゲノムが完成、および完成度の高いドラフトゲノムを選択し、微生物ゲノムデータベースMBGDやゲノム比較ツールRECOGなどを用いて、近縁anammox細菌のコアゲノム構造を明らかにする。さらに、anammox細菌が有する生理代謝機能の多様性を調べるため、生理代謝機能的ポテンシャルを評価するMAPLEを用いた解析を行い、その結果に基づくクラスタリングおよびPCA解析を行って各anammox細菌の機能分類を行う。
一方、anammox細菌がNO2-を利用せず、NOを基質とすることはトレーサー実験により確認されたので、2019年度は各分散強度における物理的性状とFISHによるanammox細菌および脱窒細菌の空間分布、15NO2-と15NOを基質とした際のanammox活性を対応づけ、anammoxと脱窒細菌が近接する時のみ、15NO2-に由来する29N2生成が認められるかを検証する。これは、2018年度予定していたがまだ未解決であるため、2019年度も引き続き行う。
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Research Products
(6 results)
