2018 Fiscal Year Annual Research Report
実環境中ウイルス検出用外力支援近接場照明バイオセンサシステム
| Project/Area Number |
17H01048
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
藤巻 真 国立研究開発法人産業技術総合研究所, エレクトロニクス・製造領域, 研究グループ長 (10392656)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島 隆之 国立研究開発法人産業技術総合研究所, エレクトロニクス・製造領域, 上級主任研究員 (10371048)
藤岡 貴浩 長崎大学, 工学研究科, 准教授 (20759691)
守口 匡子 藤田医科大学, 医学部, 講師 (60298528)
白土 東子 (堀越東子) 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 主任研究官 (60356243)
宮沢 孝幸 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (80282705)
久保田 智巳 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ付 (90356923)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | バイオセンサ / ウイルス / 免疫アッセイ / 抗体 / DNAプローブ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究開発の目的は、環境中に存在するウイルスを検知して感染を予防することができるウイルスセンサの開発である。検出ダイナミックレンジの目標値は4桁であり、検出可能レンジは、ノロウイルスを対象とした場合、既に100～100,000粒子/mlを達成している。しかし、定量性の改善、つまり安定的な検出の実現に課題が残っていた。今年度の研究から、定量性を悪くする凝集塊の発生は、磁場印加時の磁気ビーズ凝集にその一因であることが分かってきた。また、高感度化においては、ビーズの大きさを1マイクロメートルとすることによって、2×の対物レンズでの観察が可能となり、その結果、約4倍の高感度化が達成できることが分かった。一方で、磁性ビーズと標識ビーズが直接吸着してしまうことによって生じる擬陽性信号が高感度化を阻害する大きな要因の1つであることが新たに明らかになった。このように、定量性や、より一層の高感度化を達成するにあたってその阻害要因を明確にすることができた。
ノロウイルスやインフルエンザウイルス検出において、蛍光粒子を標識に用いた検出系を確立することができた。このことによって、夾雑物による散乱ノイズの影響を低減可能となり、より正確な検出が可能となった。
DNAプローブ開発においては、ビーズに修飾したプローブとターゲット分子との結合が確認でき、2019年度における検出系の確立に向けた準備が完了した。
実環境対応としては、トウガラシマイルドモットルウイルス(PMMoV)の検出において、より高い感度を得るために、外注にてモノクローナル抗体の作製を行った。水処理場において採取した実環境試料からのPMMoV検出を実施したが、PCRを用いた検査でも、複数採取したいずれの試料からもPMMoVが検出されなかったため、本試験は試料採取方法を再度検討して、2019年度に再度実施することとした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高感度検出を目標にシステムの設計を行い、広域均一照射光学系を実装した試作機を開発した。初年度は、標識用粒子に金ナノ粒子を用いると、局在型表面プラズモン共鳴によって発せられる強い散乱光を光信号として利用可能であることから、金ナノ粒子の局在型表面プラズモン共鳴を効率よく励起可能な530nmのLEDを光源として選定した。その後、蛍光粒子も標識用粒子として使用可能とするために、より波長の短い励起光源をラインナップした。センサチップは、それぞれの波長にて高い電場増強度を得られるように多層膜構造を最適化して試作した。この試作機を用い、検出試験に用いるナノ粒子の添加方法や反応時間を最適化することで、ノロウイルス検出において4桁のダイナミックレンジを達成した。また、ウイルスタンパク質をターゲットとすることによって、実質的に1粒子/1mLの検出に成功した。視野拡大による高感度化においては、2倍対物レンズでの観察に成功し、4倍の高感度化を達成した。また、蛍光粒子を標識として用いる系を確立したことにより、より正確な測定が可能となった。
DNAプローブ開発においては、インフルエンザウイルスA型の同定用プライマーとPCR産物の配列をもとに、性能試験用のビオチン化DNAプローブと検出用DNA配列をそれぞれ設計、入手して検出準備を行った。これまでに、ビーズに修飾したプローブとターゲット分子との結合を確認できている。実環境対応としては、水処理におけるウイルス検出では、PMMoVの検出に成功している。しかしながら、市販の抗体では感度が低かったことから、2018年度には外注でPMMoV用のモノクローナル抗体を作製した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ウイルス検出におけるダイナミックレンジは、目標としていた4桁を達成しているが、引き続き、定量性に課題が残っている。これまでの研究から、定量性を悪くしている凝集塊の発生は、磁場印加時の磁気ビーズの凝集も、その一因であることが分かた。ノロウイルスや動物ウイルスを対象に、抗体またはDNAプローブ付着量の最適化、ビーズの粒径やビーズの表面修飾の最適化、印加磁場強度の最適化を実施し、定量性の高い検出を実現する。高感度化においては、標識用のビーズ径を最適化することによって、視野拡大による高感度化が達成できることが分かった。しかしながら、磁性ビーズと標識ビーズが直接吸着してしまうことによって生じる擬陽性信号が高感度化を阻害する要因であることが明らかになってきたことから、ビーズペアの最適化や、ビーズ表面の非特異吸着処理などによって、システムのさらなる高感度化に取り組む。また、昨年度に引き続き、ノロウイルスの多型検出用に開発した複数種の抗体を修飾した磁気ビーズ群を用い、ウイルスの遺伝子型に依らず検出が可能であることを実証する。
DNAプローブ開発においては、プローブとターゲット分子の結合が確認できたことから、引き続き、インフルエンザウイルスA型の同定用プライマーとPCR産物の配列をもとにしたモデル系にて、検出系の構築を実施するとともに、ネコモルビリウイルスを対象とした、DNAプローブによる検出も実施する。
実環境対応としては、平成30年度にPMMoVのモノクローナル抗体を入手できたことから、水処理場において採取した処理水試料から、本抗体を用いてPMMoVを検出し、その濃度をPCRでの検出結果と比較する実験を行い、本センサの有効性を確認する。
|
