2019 Fiscal Year Annual Research Report
Why does Fugu pufferfish have a resistance to bacterial infection? Research to seek the mechanism of disease resistance in Fugu.
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17H01486
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
酒井 正博 宮崎大学, 農学部, 教授 (20178536)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹山 春子 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (60262234)
河野 智哉 宮崎大学, 農学部, 准教授 (60527547)
引間 順一 宮崎大学, 農学部, 准教授 (70708130)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 魚病細菌 / ヒラメ / トラフグ / 免疫応答 / メダカ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
水産増養殖の発展を妨げている大きな要因は魚病の問題である。一方、トラフグは他の多くの海産養殖魚種と異なり、多くの疾病に強いことが知られている。申請者は、これまでに、トラフグを中心とした魚類の免疫系の解明を行い、その研究成果を利用して多くの免疫賦活剤の開発を行い魚病の制御に貢献してきた。本研究は、トラフグの細菌感染におけるサイトカインを中心とした自然免疫機構の役割をヒラメなどの他魚種と比較することによって、トラフグの耐病性のメカニズムを明らかにし、その知見を利用してサイトカインを用いた新しい免疫賦活剤を開発し、魚病を制御することを目的としている。H31/R1年度は、新規サイトカイン遺伝子の機能解明の一環として、作製したIL-17A/F1の役割を明らかにするために、IL-17A/F1-KO（knockout）メダカと野生メダカの腸管についてメタゲノム解析を行ったところ、IL-17A/F1-KOメダカの腸内細菌叢は、野生メダカと比べて明らかに異なる細菌叢の組成をしており、日和見感染する病原菌が増加していた。この現象は、Edwardsiella piscicida（旧名: tarda）が感染したKOおよび野生メダカの腸管においても観察できた。さらに、IL-17A/Fのより詳細な役割を理解するために、IL-17受容体A（IL-17RA）遺伝子についてもクローン化を行い、ゲノム編集による変異メダカの作製を試みた。一方、ヒラメとトラフグのE. piscicida感染症に対する抵抗性を調べるために、E. piscicida感染時のヒラメおよびトラフグの血清におけるリゾチーム活性（溶菌活性）を調べたところ、トラフグ血清のリゾチーム活性の方がヒラメに比べて有意に高かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度の報告書に示した実験計画に従って、次の実験を実施した。H31/R1年度は、新規サイトカイン遺伝子の機能解明の一環として、作製したIL-17A/F1の役割を明らかにするために、IL-17A/F1-KO（knockout）メダカと野生メダカの腸管についてメタゲノム解析を行ったところ、IL-17A/F1-KOメダカの腸内細菌叢は、野生メダカと比べて明らかに異なる細菌叢の組成をしており、日和見感染する病原細菌であるPlesiomonas属やAeromonasなどが増加していた。この現象は、Edwardsiella piscicida（旧名: tarda）が感染したKOおよび野生メダカの腸管においても観察できた。以上のことより、IL-17A/F1の腸管における役割は、日和見感染症原因菌の増殖を抑制し、健康に保っていることが明らかとなった。そこで、IL-17A/F経路について、より詳細な機能を理解するために、IL-17受容体A（IL-17RA）遺伝子についてもクローン化を行い、ゲノム編集による変異メダカの作製し、ホモ変異メダカを得た。今後、これを用いて腸管におけるトランスクリプトーム解析を実施する。一方、ヒラメとトラフグのE. piscicida感染症に対する抵抗性を調べるために、E. piscicida感染時のヒラメおよびトラフグの血清におけるリゾチーム活性（溶菌活性）を調べたところ、トラフグ血清のリゾチーム活性の方がヒラメに比べて有意に高かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の研究計画は上述したように、E. tardaで処理したヒラメおよびトラフグの血清を用いた溶菌活性や病原菌に対する毒性試験などのバイオアッセイを継続して実施する（河野分担）。これと同様に、Streptcoccus iniaeを用いてヒラメおよびトラフグを処理し、遺伝子発現解析を行い、同様の血清を用いた自然免疫応答に関するバイオアッセイを行う（酒井・引間の分担）。一方、新規サイトカイン遺伝子の機能解明の一環として、魚類のIL-17A/Fのメカニズムを解明するために、作製したIL-17RA-KOメダカの腸管における網羅的なトランスクリプトームおよび腸内細菌叢の解析を行う。さらにトラフグとヒラメの腸管におけるIL-17A/Fおよび受容体遺伝子の発現パターンを比較する。最後に、魚類特有のIL-17Nの機能解明のために、組換えタンパク質の構築を行い、メダカ細胞を用いて他のサイトカイン遺伝子の発現誘導について検討する（酒井・引間の分担）。
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