上皮・内皮陥入組織における器官決定機構の解明とその制御

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H01606
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 福本 敏 東北大学, 歯学研究科, 教授 (30264253)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 保住 建太郎 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (10453804) ; 犬塚 博之 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (20335863) ; 江草 宏 東北大学, 歯学研究科, 教授 (30379078) ; 阪井 丘芳 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (90379082)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 歯 / 毛 / エナメル芽細胞 / 器官発生 / 遺伝子スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

上皮系の陥入によって生じる器官形成のメカニズムを明らかにする為に、各器官の発生段階における遺伝子発現を網羅的に解析することを試みた。これまで当研究室で実施していたマイクロアレーを用いた手法に加え、遺伝子の転写活性を手法としたスクリーニングとしてCAGE法を用いて、歯、毛、および唾液腺組織での遺伝子転写量の解析を行い、新たか候補遺伝子の同定に成功した。更に切歯および臼歯から細胞を調整し、それぞれ約6000細胞を用いて、single cell RNA sequenceを行い、個々の細胞がどのような遺伝子をどの程度発現しているのかを明らかにした。その結果、切歯を用いた解析においては、歯原性上皮幹細胞から、内外エナメル上皮、中間層、星状網の細胞集団に加え、内エナメル状にについては分泌期および成熟期のエナメル芽細胞の分化段階に至るまで、どの細胞がどのように分化していくのかを遺伝子譜系で明らかにすることができた。
また、CAGE法やsingle cell RNA sequenceを用いて同定したいくつかの遺伝子に関しては、組織内発現をin situ hybridization法や蛍光免疫染色法を用いて解析した結果、包括的な遺伝子スクリーニングの結果と一致して、各上皮組織特異的な発現を確認することができ、少なくとも歯においては、各上皮細胞の分化特異的なマーカー分子の同定に成功した。これらのデータを元に、毛の発生段階における各スクリーニングのデータベースと比較することで、上皮系の陥入器官の運命決定に関わる因子の同定を行う準備が完了した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

これまで本研究室で実施していた歯胚と毛包組織との包括的遺伝子スクリーニングで得られた分子の機能解析については、Sox21、AmeloD、GPR115等を中心に細胞レベルの解析を実施した。Sox21に関しては、細胞内の蛋白分解に関わるAnapc10の遺伝子発現を直接制御し、上皮細胞マーカーの１つであるE-cadherinの発現調節を行っていることを見出した。AmeloDに関しては、新規の歯特異的bHLH型転写として同定したが、本分子を欠損させたマウスを作成した結果、歯の大きさが小さくなり、歯根も短くなることを発見した。in vitroの解析からAmeloDは、E-cadherinの発現を抑制する分子であり、上皮細胞の移動（migration）に関連していることを見出した。Sox21およびAmeloDに関する研究については、いずれも論文投稿まで行うことができた。
一方、CAGE法やsingle cell RNA sequence等の新たな遺伝子スクリーニングにより、歯胚のおいてどの細胞がどういった譜系で分化していくのかを明らかにすることができた。歯原性上皮幹細胞から、内外エナメル上皮、中間層、星状網の細胞集団に加え、内エナメル状にについては分泌期および成熟期のエナメル芽細胞の分化段階に至るまでの遺伝子発現を１細胞レベルで明らかにすることができ、これまで特定の細胞集団でした存在しなかった細胞マーカーについても、全ての細胞において同定することに成功した。
このような背景から、これまで同定していた遺伝子に関しては論文投稿まで漕ぎ着けることができ、また器官発生に関わる新たな遺伝子の同定も数十種類明らかにすることができたため、当初の計画以上に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

CAGE法やsingle cell RNA sequence等を用いて新たに同定した分子については、歯、毛および唾液腺の発生段階二おける組織発現を検討するとともに、歯原性上皮細胞、皮膚上皮細胞等に発現ベクターを用いた過剰発現、siRNA等を用いた遺伝子発現抑制を行うことで、各器官の細胞分化に及ぼす影響を検討する。この中で、細胞分化に影響を及ぼすことが確認できた遺伝子に関して、器官培養を用いたex vivo解析や、遺伝子改変マウス等を作成し、これらを用いたin vivo解析を実施する。
器官の運命決定に関わる分子に関しては、当教室で作成したマイクロアレーデータベースや、CAGE法やsingle cell RNA sequence等より得られたデータについて器官ごとに比較することで、Sox21と同様のスクリーニングと機能解析を実施する。また器官や組織特異的な発現を示す分子に関しては、ヒトの疾患発症に関連していることが多いため、歯や毛に異常を示す疾患の症例報告等についても文献的に、あるいは学会等での情報収集をしながら、単に個々の遺伝子解析のみならず、ヒト疾患の診断や治療に発展させられるような準備を進める。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 米国国立衛生研究所（NIH）(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: 米国国立衛生研究所（NIH）
• [Int'l Joint Research] 北京大学(中国)
  • Country Name: CHINA
  • Counterpart Institution: 北京大学
• [Int'l Joint Research] 全南大学(韓国)
  • Country Name: KOREA (REP. OF KOREA)
  • Counterpart Institution: 全南大学
• [Journal Article] Piezo type mechanosensitive ion channel component 1 functions as a regulator of the cell fate determination of mesenchymal stem cells. (2017)
  • Author(s): Sugimoto A, Miyazaki A, Kawarabayashi K, Shono M, Akazawa Y, Hasegawa T, Ueda-Yamaguchi K, Kitamura T, Yoshizaki K, Fukumoto S, Iwamoto T.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 7(1) Pages: 17696
  • DOI: 10.1038/s41598-017-18089-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] NOTCH2 Hajdu-Cheney Mutations Escape SCFFBW7-Dependent Proteolysis to Promote Osteoporosis. (2017)
  • Author(s): Fukushima H, Shimizu K, Watahiki A, Hoshikawa S, Kosho T, Oba D, Sakano S, Arakaki M, Yamada A, Nagashima K, Okabe K, Fukumoto S, Jimi E, Bigas A, Nakayama KI, Nakayama K, Aoki Y, Wei W, Inuzuka H.
  • Journal Title: Mol Cell Volume: 68(4) Pages: 645-658
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2017.10.018
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mediator 1 contributes to enamel mineralization as a coactivator for Notch1 signaling and stimulates transcription of the alkaline phosphatase gene. (2017)
  • Author(s): Yoshizaki K, Hu L, Nguyen T, Sakai K, Ishikawa M, Takahashi I, Fukumoto S, DenBesten PK, Bikle DD, Oda Y, Yamada Y.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 292(33) Pages: 13531-13540
  • DOI: 10.1074/jbc.M117.780866
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Pannexin 3 regulates proliferation and differentiation of odontoblasts via its hemichannel activities. (2017)
  • Author(s): Iwamoto T, Nakamura T, Ishikawa M, Yoshizaki K, Sugimoto A, Ida-Yonemochi H, Ohshima H, Saito M, Yamada Y, Fukumoto S.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12(5) Pages: e0177557
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0177557
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Nephronectin plays critical roles in Sox2 expression and proliferation in dental epithelial stem cells via EGF-like repeat domains. (2017)
  • Author(s): Arai C, Yoshizaki K, Miyazaki K, Saito K, Yamada A, Han X, Funada K, Fukumoto E, Haruyama N, Iwamoto T, Takahashi I, Fukumoto S.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 7 Pages: 45181
  • DOI: 10.1038/srep45181
  • Peer Reviewed / Open Access