2017 Fiscal Year Annual Research Report
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17H02220
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
永井 拓 名古屋大学, 医学部附属病院, 准教授 (10377426)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 教道 名古屋大学, 医学部附属病院, 特任助教 (30726310)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | リン酸化シグナル / 情動 / ドパミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
情動とは喜び、悲しみ、怒り、恐怖、不安というような激しい感情の動きであり、これはある感覚情報に対する脳の反応で人間が生きていくうえで欠かすことができない脳の働きである。快・不快情動については、大脳基底核と前頭前皮質、扁桃体や海馬などの関連領域で形成される神経回路（大脳皮質－大脳基底核ループ）が重要な役割を果たしている。報酬や嫌悪刺激などは腹側被蓋野のドーパミン神経細胞の発火頻度を変え、側坐核に情報を伝える。側坐核にはドーパミンD1受容体（D1R）を発現する中型有棘神経細胞、ドーパミンD2受容体（D2R）を発現する中型有棘神経細胞、γ-アミノ酪酸（GABA）およびアセチルコリン作動性介在神経細胞が存在し、約90%は中型有棘神経細胞で占められている。D1R-中型有棘神経細胞は腹側淡蒼球および中脳へ、D2R-中型有棘神経細胞は腹側淡蒼球に特徴的な神経軸索の投射パターンを示すことから、これら中型有棘神経細胞は、複数の神経入力を統合して適切な情動行動が実行できるように情報を出力するインテグレーターとして機能している。我々は、新たに開発したリン酸化プロテオミクス法により、マウスの側坐核で起こるリン酸化反応を網羅的に解析し、D1Rの下流でリン酸化されるタンパク質を100種類以上同定した。それらの情報を基に、情動行動制御に関わるシグナル伝達経路を絞り込み、ドーパミンがD1R-中型有棘神経細胞を介して快情動行動を生み出すしくみ（作用機構）をこれまで解析してきた。しかしながら、D2R-中型有棘神経細胞の情動行動における役割やその制御機構については未だ不明な点が多い。平成29年度は、D2R-中型有棘神経細胞におけるリン酸化シグナルの解析に焦点を絞り、薬理学的刺激に伴うRasgrp2およびRap1gapのリン酸化を指標にPKA活性のプロファイリングを実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
7週齢のマウスより側坐核を含む線条体の急性スライス標本を作成し、A2AR作動薬（CGS21680）を処置した際にリン酸化Rasgrp2（Ser116/117, Ser554, Ser586）およびリン酸化Rap1gap（Ser563）レベルが亢進するかどうかをイムノブロット法により調べた。溶媒を処置したコントロールに比べて、Rasgrp2およびRap1gapのリン酸化はCGS21680の処置により有意に増加した。CGS21680処置によるRap1gapのリン酸化の亢進はドパミンD2R拮抗薬のquinpiroleによって抑制された。一方、quinpiroleの単独処置はRap1gapのリン酸化レベルに有意な変化を与えなかった。さらに、D2R拮抗薬（Eticlopride）についてもRap1gapのリン酸化レベルが亢進すること、A2AR拮抗薬の前処置により抑制されるかことを示した。急性スライス実験で得られた結果をもとに成体マウスにA2AR作用薬を腹腔内投与した後に側坐核を摘出し、PKAの活性をin vivoでモニターした結果、CGS21680を投与したマウスではRap1gapのリン酸化が僅かに増加した。一方、D2R拮抗薬を投与したマウスの側坐核においてリン酸化Rap1gapのレベルが著しく増加した。また、リン酸化Rasgrp2が側坐核のD2R-中型有棘神経細胞で増加するかどうかを調べるために、D2R-中型有棘神経細胞を蛍光タンパク質で標識したトランスジェニックマウス（D2R-YFP）にD2R拮抗薬を投与し、抗リン酸化Rap1gap抗体を用いた免疫染色を行った結果、リン酸化Rap1gapの免疫活性がD2R-中型有棘神経細胞で観察された。
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| Strategy for Future Research Activity |
側坐核D2R-中型有棘神経細胞特異的にPKAを発現させたマウスの作製とリン酸化解析を行う。具体的には、D2Rプロモーターの下流でCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス（D2R-Creマウス）の側坐核にCre依存的に野生型、恒常活性型PKA変異体およびドミナントネガティブ型PKA変異体を発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）を注入し、側坐核D2R-中型有棘神経細胞特異的にPKAの活性を操作する。この時に緑色蛍光タンパク質も同時に発現させることにより遺伝子操作された細胞が識別できるようにする。実体蛍光顕微鏡下で、遺伝子導入された蛍光を発する線条体組織を摘出してRasgrp2のリン酸化レベルをイムノブロット法で測定し、PKA活性を制御できていることを確認する。これら野生型および恒常活性型PKAを側坐核のD2R-中型有棘神経細胞に遺伝子導入したマウスを用いて情動行動を解析し、PKAの活性に依存して快・不快情動行動が変化するかどうかを調べる。快情動行動の指標としてコカイン投与による条件付け場所嗜好性試験を行う。不快情動行動の指標としてリチウム投与による条件付け場所嫌悪性試験を行う。さらに、PKAの活性化はRap1gapのリン酸化を介してRap1を活性化することから、線条体の急性スライス標本を用いてA2AR作動薬（CGS21680）を処置した際の活性化型Rap1（Rap1-GTP）の量をプルダウンアッセイ法により測定する。また、D2R拮抗薬（Eticlopride）についても活性化型Rap1レベルが亢進するかどうかを検討する。さらに、急性スライス標本で得られた結果をもとに、A2AR作用薬やD2R作用を投与したマウスの側坐核における活性化型Rap1（Rap1-GTP）の量をin vivoで測定し、PKA下流シグナルRap1の活性化機構と機能解析を進める。
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[Journal Article] Astroglial major histocompatibility complex class I following immune activation leads to behavioral and neuropathological changes.2018
Author(s)
Sobue, A., Ito, N., Nagai, T., Shan, W., Hada, K., Nakajima, A., Murakami, Y., Mouri, A., Yamamoto, Y., Nabeshima, T., Saito, K., Yamada, K.
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Journal Title
Glia
Volume: 66
Pages: 1034-1052
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Neuronal PAS domain protein 4 (Npas4) controls neuronal homeostasis in pentylenetetrazole-induced epilepsy through the induction of Homer1a.2018
Author(s)
Shan, W., Nagai, T., Tanaka, M., Itoh, N., Furukawa-Hibi, Y., Nabeshima, T., Sokabe, M., Yamada, K.
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Journal Title
J. Neurochem.
Volume: 145
Pages: 19-33
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice.2018
Author(s)
Wulaer, B., Nagai T., Sobue, A., Itoh, N., Kuroda, K., Kaibuchi, K., Nabeshima, T., Yamada, K.
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Journal Title
Gene Brain Behav
Volume: -
Pages: -
Peer Reviewed
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[Journal Article] Exposure to diphtheria toxin during the juvenile period impairs both inner and outer hair cells in C57BL/6 mice.2017
Author(s)
Konishi, A., Ohgami, N., Matsushita, A., Kondo, Y., Aoyama, Y., Kobayashi, M., Nagai, T., Ugawae, S., Yamada, K., Kato, M., Kiyama, H.
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Journal Title
Neuroscience
Volume: 351
Pages: 15-23
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants.2017
Author(s)
Kubo, K.I., Deguchi, K., Nagai, T., Ito, Y., Yoshida, K., Endo, T., Benner, S., Shan, W., Kitazawa, A., Aramaki, M., Ishii, K., Shin, M., Matsunaga, Y., Hayashi, K., Kakeyama, M., Tohyama, C., Tanaka, K.F., Tanaka, K., Takashima, S., Nakayama, M.
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Journal Title
JCI Insight.
Volume: 2
Pages: 88609
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Valocin-containing protein (VCP) is a novel IQ motif containing GTPase activating protein 1 (IQGAP1) interacting protein.2017
Author(s)
Itoh, N., Nagai, T., Watanabe, T., Taki, K., Nabeshima, N., Kaibuchi, K., Yamada, K.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 493
Pages: 1384-1389
DOI
Peer Reviewed
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