2019 Fiscal Year Annual Research Report
The study on the transport mechanism of light-driven inward proton pump and its application to optogenetics
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17H03007
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
井上 圭一 東京大学, 物性研究所, 准教授 (90467001)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ロドプシン / プロトンポンプ / オプトジェネティクス / レーザー分光 / レチナール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は引き続き本研究の主な研究対象である、光駆動内向きH+ポンプ（PoXeR）を中心とした各種微生物型ロドプシン分子について、機能解析や分光測定などを行い、分子機能や機能発現メカニズムについて研究を行った。またイスラエル工科大学およびチェコ科学アカデミーのグループとの共同研究によって、アスガルド古細菌より新たに見つかったシゾロドプシン（SzR）がPoXeRよりもさらに輸送効率の高い、光駆動内向きH+ポンプであることを明らかにした。アスガルド古細菌は真核生物の祖先である原核生物に、最も近い古細菌であるとして注目されているが、本研究で初めてアスガルド古細菌が光エネルギーを使って細胞内にH+を取り込むためにSzRを利用していることを明らかとした。
そして主に分光計測や変異体を用いたイオン輸送活性計測によって、内向きH+輸送にシッフ塩基のH+が関わり、さらにタンパク質内部でのH+移動に重要な残基の決定に成功した。また進化的に離れているにも関わらず、三量体構造や荷電アミノ酸の分布、光反応中間体のダイナミクスなど多くの点でSzRとPoXeRの間に共通した特徴があることを見出し、同じ内向きH+ポンプ機能を達成するために、分子レベルでの収斂進化が起こっていることを示唆する結果を得た。そしてこれらの知見をSci. Adv.誌に報告した。
その他PoXeRを含めた多くのロドプシンの吸収を長波長化できるアミノ酸変異法を見出し、Nat. Commun.誌に報告した。この技術は今後長波長吸収型のオプトジェネティクスツール開発において、有用な技術となる事が期待される。また2018年度に報告したヘリオロドプシン（HeR）の結晶構造を新たにNature誌に報告した。これらを含め2019年度は本研究課題によって得られた研究成果を主に８報の論文と13件の招待講演として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
2019年度は新たにPoXeRとは進化的に独立した内向きH+ポンプ型ロドプシンであるSzRを報告し、さらにそれらの輸送機構の多様性について明らかにするなど、当初の計画以上に内向きH+ポンプについてのメカニズム研究の進展がみられた。さらにPoXeRを含む多くのロドプシンで、５番目の膜貫通ヘリックスに保存されたプロリン残基を変異することで、イオン輸送活性を損なわずに吸収波長を長波長化できることを見出した。これによりPoXeRなどをもとにした、新たなオプトジェネティクスツールの開発が期待される。
その他、2018年度に報告したHeRについて、新たにX線結晶構造解析による三次元構造の解明に成功した。その中で当初予想されていなかった、外界とタンパク質内部のレチナール結合ポケットをつなぐ横穴構造が存在することを見出した。これについてさらに生化学的な実験によりHeR内部へのレチナールの結合時において、外界からのレチナールがこの横穴構造を通ってタンパク質内部に結合することを明らかにした。2018年度にHeRを持つ生物種の大部分はゲノム上にレチナール合成酵素を持たないことを報告したが、今回の結果は外界に存在するレチナールを自発的に捉えることでHeRが光受容機能を獲得できることを示唆しており、HeRの分子構造の生理学的な役割についても知見を得ることができた。
また2019年度はオプトジェネティクスツールとしての利用が行われている、Gloeobacterロドプシンについて新たに三次元結晶構造解析に成功した一方で、多くのロドプシンで機能に重要な、３番目の膜貫通ヘリックスのアミノ酸配列が他と大きく異なるTATロドプシンが、光励起後マイクロ秒以内に始状態に戻るという新奇なフォトサイクルを示すという知見も得た。この様に内向きプロトンポンプだけでなく、多くのロドプシンの研究において当初の計画以上の進展が見られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の研究によりPoXeRやSzRに関して、その光駆動内向きプロトンポンプ機能を達成するメカニズムについて多くの知見を得ることに成功した。今後はさらに他の生物種由来のXeRやSzRについても輸送過程の研究を行い、既知の分子との共通点や相違点について明らかにすることで、より本質的なメカニズムの理解に取り組む。一方SzRについては得られている構造情報が少ないことから、より詳細な分子構造についての知見を得るための研究を実施する。そして異なる外部環境下や、アミノ酸変異体の光反応ダイナミクスや構造情報を調べることで、SzRの輸送メカニズムに対するより詳細な知見を得る。
さらに上記の分子の中から、H+の輸送活性が高いものについては、ホ乳類細胞に導入し、オプトジェネティクスツールとしての有用性を評価する。特に現在ツール開発が遅れているシナプス小胞やミトコンドリアにターゲティングした分子を作製することで、これらの細胞小器官選択的なH+濃度勾配の光制御技術の実現に挑む。XeRやSzRについて、ホ乳類細胞中でも安定的にタンパク質が発現され、光依存的なイオン輸送活性を示すことはすでに実験から明らかとしているが、細胞小器官へのターゲティング方法については確立されていない。そこで2020年度においてはシグナル配列を含めた遺伝子コンストラクトの構築を網羅的に検討し、応用に資する小器官への高い移行効率を示す分子の実現を目指す。
その他2018年度、2019年度において得られた機械学習法や選択的アミノ酸変異による、吸収波長制御技術のさらなる高度化を目指した研究を行う。さらに量子化学計算にもとづいた、レチナールの長波長吸収化を意図したアミノ酸改変体の論理的デザインを行い、これらのアプローチを統合することで、長波長光に対してこれまでになく高い応答能を持つ分子の実現を目指した研究を行っていく。
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[Journal Article] Schizorhodopsins: A Novel Family of Rhodopsins from Asgard archaea that Function as Light-Driven Inward H+ Pumps2020
Author(s)
Keiichi Inoue*, Satoshi P. Tsunoda, Manish Singh, Sahoko Tomida, Shoko Hososhima, Masae Konno, Ryoko Nakamura, Hiroki Watanabe, Paul-Adrian Bulzu, Horia L. Banciu, Adrian-Stefan Andrei, Takayuki Uchihashi, Rohit Ghai, Oded Beja, Hideki Kandori*
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Journal Title
Science Advances
Volume: 6
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Crystal Structure of Heliorhodopsin2019
Author(s)
W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S. Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, T. Izume, S. Okazaki, M. Hashimoto, R. Mizutori, S. Tomida, Y. Yamauchi, R. A.-Yoshizumi, K. Katayama, S. P. Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A. Pushkarev, Oded Beja, T. Uchihashi, H. Kandori*, O. Nureki*
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Journal Title
Nature
Volume: 574
Pages: 132-136
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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