2017 Fiscal Year Annual Research Report
Functional and morphological survey of the involvement of autophagy in stress and emotional system
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17H03553
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80264753)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
辻村 敦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50236890)
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60462701)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | オートファジー / 遺伝子改変マウス / NPYニューロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジーは細胞内タンパク質分解機構の一つで神経変性疾患などへの関与が知られているが、本研究ではストレス・情動系へのオートファジー関与をストレスモデル、遺伝子改変マウスを用いて明らかにすることを目的とし、平成29年度はストレス負荷と脳内オートファジーの関連性を調べるためにフットショックによるモデルマウスの作製を行った。ショックジェネレーターにより5秒間4回の電気ショックの負荷を行い、翌日恐怖条件付けを測定した。その後、マウスの灌流・固定を行い、抗LC3抗体を用いて免疫組織化学染色で脳内のオートファジー活性を調べた。しかし、免疫組織化学染色によるオートファジー活性の正確な測定は困難であった。そこで脳内オートファジー活性の測定のために新たなレポーターシステム（GFP-LC3-RFP-LC3ΔG）を導入したマウスを作製した。このマウスは神経特異的にGFP-LC3-RFP-LC3ΔGを発現しており、神経細胞内でのオートファジー活性をモニタリングできる。今後、このマウスを用いストレス負荷とオートファジー活性の関連性を調べる。
うつ様行動における側坐核NPYニューロンの役割を解析するために、DREADDテクノロジーを用い側坐核NPYニューロンの活性化を行った。NPY-Creマウスの側坐核でAAVウイルスを用いhM3Dデザイナー受容体を発現させ、clozapine-N-oxideの腹腔内投与により側坐核NPYニューロンの活性化を行った。その後、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、強制水泳試験、尾部懸垂試験を行った。現在、マウスの作製および行動解析は継続中である。
さらに、NPY-Creマウスの側坐核でヒトHB-EGFを発現させ、ジフテリア毒素の投与により側坐核NPYニューロンを特異的に破壊したマウスを作製した。これらマウスの行動解析も行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
神経特異的なオートファジー活性を測定するためのレポーターシステム（GFP-LC3-RFP-LC3ΔG）を発現したマウスの作製に時間がかかったが、29年度内に終了し、30年度はこのマウスを用いたストレスモデルのオートファジー解析を行う予定である。その間NPY-Creマウスを用いた情動モデルの検索も同時並行で行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に作製したトランスジェニックマウスが、実際に神経特異的にオートファジー活性を可視化できるのかを確認する。まず、胎児大脳皮質から初代神経培養を行う。血清除去による飢餓培養やラパマイシン投与を行って、オートファジーを誘導させると、オートファゴゾームが形成され赤色に変化し、オートファジーfluxに比例して赤：緑の比が増加することを確認する。次にフットショックや拘束ストレスを負荷して、扁桃体、側坐核、前頭前野の領域の神経細胞のオートファジー活性化を検出できるか検索する。昨年度はLC3抗体でストレス負荷後の大脳辺縁系にオートファゴゾーム様のドットが細胞内に出現するか調べたが、対照群に比べて有意な増加を検出することが難しかったので、このマウスでオートファジー活性の程度が可視化、定量できることを期待している。また、視床下部NPYニューロンが摂食亢進に伴ってオートファジーを起こすことが報告されているので、NPY-Creマウスと交配させたマウスにNPYニューロン特異的にチャネルロドプシン2を発現させて活性化させるとオートファジーが起こるかを検索する。また高脂肪食を食べさせたマウスも作製して検索する。そして、昨年度に引き続き側坐核NPYニューロンが情動に関与するかをDREADDシステムを用いて検索し、NPYニューロンの変化がオートファジーを伴うかについても検索を進めていく。
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