2017 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光バイオセンサーを用いたミトコンドリア分岐鎖アミノ酸輸送体の同定およびその解析
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17H03654
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 分岐鎖アミノ酸 / トランスポーター / ライブイメージング / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.ミトコンドリア内への分岐鎖アミノ酸流入速度を定量的に計測する系の確立
培地中の各アミノ酸濃度を変化させ、分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーを細胞質に発現した細胞のイメージングをおこなうことによって、このバイオセンサーが細胞内においても分岐鎖アミノ酸に対して特異性を有していることを確認した。次に、cytochrome c oxidase subunit 8のミトコンドリアマトリ ックス局在化シグナルを直列に2つ繋いだ配列を分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーに付加することにより、分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーをミトコンドリア内に局在させることに成功した。アミ ノ酸を含まない培地に分岐鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）を加えると、ミトコンドリア内に局在させたバイオセンサーのFRET効率が上昇したことから、この測定系を用いることによってミトコンドリア内膜における分岐鎖アミノ酸流入速度を経時的に測定できると考えられた。
2.分岐鎖アミノ酸流入速度を指標とした輸送体のスクリーニング
主に質量分析を用いたミトコンドリア局在タンパク質の網羅的解析によって、ヒトでは機能未知遺伝子を含む 計1158の遺伝子がミトコンドリアに局在するタンパク質をコードしていることが示されている。このうち、SLC ファミリー輸送体およびABCファミリー輸送体をコードすることが予想されている約70の遺伝子に対するsiRNAラ イブラリーを作製した。蛍光バイオセンサーをミトコンドリアに恒常発現する細胞をsiRNAで処理したのち、分岐鎖アミノ酸を培地中に加えた際のFRET効率の変化を測定した。輸送体の遺伝子がノックダウンされた場合は分岐鎖アミノ酸流入速度が低下すると予想されたが、有意に低下した遺伝子は見出されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度では、（１）ミトコンドリア内への分岐鎖アミノ酸流入を測定する系を確立し、その系を用いることで（２）ミトコンドリア内に分岐鎖アミノ酸を輸送する分子の候補遺伝子を同定する予定であった。（１）についてはほぼ計画通りに進んだものの、（２）については年度中に候補遺伝子を同定するところまで達成することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度から引き続き、ミトコンドリア内膜の分岐鎖アミノ酸トランスポーター遺伝子の候補を絞り込む。前年度においては、3種類すべての分岐鎖アミノ酸を培地中に添加した際のミトコンドリア内分岐鎖アミノ酸濃度を測定していたが、３つの分岐鎖アミノ酸が別々のトランスポーターで輸送されている場合は、この測定方法で遺伝子を絞り込むことが困難である。そこで、今後はまずひとつひとつの分岐鎖アミノ酸に絞ってトランスポーターのRNAiスクリーニングをおこなう。
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