2018 Fiscal Year Annual Research Report
表面分析法による菌根における炭素・窒素・水素の細胞輸送と循環解析
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17H03784
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
久我 ゆかり 広島大学, 総合科学研究科, 教授 (30232747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 直哉 北海道大学, 創成研究機構, 助教 (30466429)
勝山 千恵 広島大学, 総合科学研究科, 助教 (10580061)
長谷川 巧 広島大学, 総合科学研究科, 助教 (20508171)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 菌根 / 安定同位体トレーサー / 二次イオン質量分析法 / 凍結法 / 微細構造 / 菌糸圏土壌微生物 / 顕微ラマン分光法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，植物と真菌の共生である菌根において、炭素、窒素、水素の共生者間－組織内輸送および環境との循環を、細胞小器官レベルでの局在解析手法を中心に明らかにすることを目的としている。
課題Ⅰ「表面分析法における試料調整法の影響評価」では，凍結試料を用いた安定同位体トレーサーの二次イオン質量分析法（SIMS）の開発に引き続き取り組んだ。高真空装置で凍結試料を測定するための，試料側の凍結法，表面作成法など，また，機械的な試料輸送・導入法，凍結ステージの開発はほぼ完成した。H30年度は特に，表面の導電性の改良に取り組み，測定法などの検討を行った。生細胞における安定同位体測定法の検討では，酵母をモデルとして用い，同位体標識リン酸を与えた真菌液胞内のポリリン酸の動態・分布を顕微ラマン散乱の手法を用いて明らかにすることを目指し，測定手法の確立に引き続き取り組んだ。本年度は，樹脂包埋試料作製における方法論の違いを検討するため，加圧凍結-凍結置換法の導入を検討した。
課題Ⅱ「同位体分子情報」では，アーバスキュラー菌根共生における宿主から渡される分子として推定される脂質および糖質の解析のため，TOF-SIMS法の導入に着手した。
課題Ⅲ「物質輸送と循環」では，アーバスキュラー菌根における物質輸送を同位体トレーサーの微細構造局在解析により明らかにするため，本研究で確立した同一試料を用いた透過型電子顕微鏡-SIMS法解析法を用い，分析を進めた。また，アーバスキュラー菌根における水輸送を解析するため，菌糸のみにトレーサーを与える培養系を確立した。土壌生態系における元素循環では，温度ストレスを与えた土壌中の菌糸圏微生物群（細菌および糸状菌）について，次世代シークエンサーを用いた群集構造解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題Ⅰの凍結SIMS分析法について，凍結分析面作製－凍結試料輸送－SIMS凍結測定の主要な工程はほぼ確立し，データ取得の成否を左右する凍結表面の導電性処理について大きく進展し，全過程が確立した。ラマン分光法では，液胞内ポリリン酸の観察モデル系として酵母を用い，生体試料の特徴による問題の回避のため凍結乾燥法による全細胞分析を検討し，さらに問題点を絞り込んだ。さらに，脱水の影響を検討するため，加圧凍結-凍結置換法による試料作製に着手した。
課題Ⅱでは，アーバスキュラー菌根における宿主からの輸送分子として推定されている脂質や糖質分析として，TOF-SIMS法による解析に着手した。
課題Ⅲでは，アーバスキュラー菌根において，菌糸のみへのラベルが可能なチャンバーの開発を行い，宿主が固定した13Cおよび共生菌由来15Nの輸送・交換解析を微細構造レベルで行っている。生態系内循環解析では温度ストレスをかけた土壌中の菌糸圏微生物変動解析では，次世代シークエンサーによる網羅的な解析を進め，PICRUSTを用いた機能ポテンシャルの推定を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題Ⅰ（表面分析法における試料調整法の影響評価）においては，H30年度に確立した方法を用い，凍結菌根標識組織におけるデータの取得を進める。手法の比較を行うため，同一試料を用いた凍結分析と加圧凍結・凍結置換法あるいは定法（化学固定・エタノール脱水）による樹脂包埋試料作成手順を確立する。これらの３つの手法で，ラベルの局在，同位体比の強度等比較する。顕微ラマン分光では18Oラベルポリリン酸計測法の検討のため，凍結乾燥後樹脂包埋した酵母細胞をモデルとし解析を行う。
課題Ⅱ（同位体分子情報）においては，１）一原子標識化合物を用いた輸送解析として，ラン共生プロトコームを用い，グリシン2-13C ，酢酸1-13C，パルミチン酸ナトリウム1-13C をトレーサーとして，Dynamic SIMSによる局在およびガス解析を行う。また２）TOF-SIMSによる分子解析として，同位体ラベルしたアーバスキュラー菌根の樹脂切片を用い，特に，近年宿主から共生菌への輸送物質として推定されている脂質および植物体内長距離輸送物質と考えられている糖質について局在解析に取り組む。
課題Ⅲ（物質輸送と循環）では，１）アーバスキュラー菌根におけるCおよびN輸送解析として，菌根植物への13CO2および外生菌糸への15NH4ラベルを行い，引き続きTEM-nanoSIMS法による微細構造レベルでの同位体局在解析を行う。構築した仮説について，ペチュニアの菌根自然変異体を用いた検証を行う。さらに，個別ラベルシステムを構築し，経時的解析およびD2Oの輸送・循環解析に着手する。また，２）糸状菌―土壌微生物群集間の物質輸送の起点となる真菌遺伝子を探索する。
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