2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of the fish pathogenic bacterial infection prevention technique utilizing the polysaccharide recognition mechanism derived from pathogenic bacteria
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17H03863
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
引間 順一 宮崎大学, 農学部, 准教授 (70708130)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木下 政人 京都大学, 農学研究科, 助教 (60263125)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 魚病細菌 / LPS 認識 / メダカ / ゲノム編集 / ヒラメ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、LPSを認識する機構を明らかにすることで、細菌感染を防御する重要な遺伝子を特定することができると考えた。また、ノックアウト(KO)メダカを使用することでLPS認識メカニズムをより分かりやすく解明し、効果的に病原細菌防御能を高める遺伝子を特定することを目的にして研究を行ってきた。
H30年度は、まず、作製した抗メダカIL-1β抗体の評価を行うために、メダカIL-1β遺伝子を過剰発現したメダカ胚細胞(HdrR-e3)を溶解した試料を用いてウエスタン・ブロッティングを行ったところ、IL-1βを特異的に検出することができた。次に、作製したASC変異メダカ（F３）を用いて、Edwardsiella tarda （細胞内寄生細菌）に対する感染試験を実施した。作製したASC変異メダカの累積生残率が、野生型メダカに比べて有意に高かったことから、ASCに関わる炎症応答経路が、E. tardaの感染に何らかの影響を与えたことで、E. tardaに対する感受性が低下したと考察した。そこで、この理由を解明するために、E. tarda感染時における炎症性サイトカイン遺伝子群の発現解析を行った。また、ASCの機能の確認として、同感染メダカにおけるIL-1βタンパク質の活性化および活性酸素(ROS)の産生について検討した。活性化されたIL-1βタンパク質は、E. tarda感染した野生型およびASC変異メダカの両方で検出された。また、E. tarda感染したASC変異メダカのROS産生能は、野生メダカと比べて有為に低かった。以上の結果から、ASCがE. tarda感染に重要な役割を果たしていることが示唆された。最後に、CASP-1遺伝子変異メダカの作製のために、メダカCASP-1遺伝子を同定および解析した後に、CRISPR/Casシステムを用いてCASP-1遺伝子変異メダカの作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
前年度の報告書に示した実験計画として、４つの実験を実施した。まず、抗メダカIL-1β抗体の特異性評価を行い、メダカIL-1βおよびCASP-1遺伝子を過剰発現したメダカ胚細胞(HdrR-e3)を溶解した試料を用いてウエスタン・ブロッティングを行うことで、IL-1βタンパク質の検出を行い、抗メダカIL-1β抗体の特異性を確認し、活性化したIL-1βタンパク質の検出を行った。次いで、作製したASC変異メダカ（F３）世代を増やし、ホモASC変異メダカを用いて、Edwardsiella tardaによる感染実験を実施した。この結果において、ASC変異メダカの方が野生型メダカよりE. tardaに対する感受性が低下したことにより、E. tarda感染経路においてASC働きが影響していることが示唆され、詳細は今後の課題とした。また、細胞内異性細菌でない病原菌に対する感受性についても検討する必要があると考えた。最後に、ASC働きがインフラマソームやASCスペックを介して炎症応答を惹起しているのであれば、それらの現象を共に機能させているカスパーゼの役割を確認する必要があるため、CRISPR/Cas9によりCASP-1遺伝子変異メダカの作製を試みた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度の研究計画として、作製した特異的抗メダカIL-1β抗体を用いて、活性化したIL-1βタンパク質の検出をより詳細に行う。特に、ASC変異メダカを用いて、病原細菌やLPS等により刺激した後のIL-1βの活性化について確認する。次に、E. tardaのような細胞内寄生細菌ではないAeromonas hydrophilaを用いてASC変異メダカに感染させた時の累積生残率や炎症性サイトカイン遺伝子の発現解析を実施し、E. tarda感染の結果と比較検討を行う。さらに、インフラマソームなど活性化の下流で起こる炎症応答を明らかにするためにHMGB1の役割についても解明する。まず、メダカHMGB1遺伝子の同定や遺伝子発現解析等の基盤的解析を行い、E. tardaなどの細菌感染との関連性を確認する。
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