2017 Fiscal Year Annual Research Report
エピゲノム制御機構の破綻によるグリオーマ発生・進展機構の解明と治療標的の探索
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17H04300
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
武笠 晃丈 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (90463869)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永江 玄太 東京大学, 先端科学技術研究センター, 講師 (10587348)
田中 將太 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80643725)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | グリオーマ / エピゲノム / メチル化 / 腫瘍発生 / 悪性化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Isocitrate dehydrogenase (IDH)遺伝子に変異を持つ神経膠腫(glioma)の一群(IDHm_G)は、経過中に高頻度に悪性転化を起こし、死に至る事で知られる。悪性転化を引き起こす要因に関しては、特定遺伝子のamplificationやdeletion、細胞の分化障害などが指摘され多くの研究がなされてきたが、単一の原因は特定されず未だ全貌は明らかになっていない。我々は独自の先行研究に基づき、悪性転化に伴うDNAのメチル化変動及びヒドロキシメチル化変動、またそれに伴う遺伝子発現の変化が悪性転化の一因になっていると予想し、これらの解析研究を施行した。
本研究では、まずは、東京大学脳神経外科や共同研究施設において手術を受けた神経膠腫腫瘍検体DNAに定期的にサンガーシークエンスを実施し、IDHm_GのDNAの追加収集を継続した。そして、これらIDHm_GのDNA 及び、U87、BT142等の脳腫瘍細胞株の培養で得たDNA等に対しEPIC methylation array (Illumina)を用いてゲノム上約85万箇所のDNAメチル化及びヒドロキシメチル化を評価した。さらに、これら検体に対し、これまでに確立したTet-assisted bisulfite(TAB)-chip法によるヒドロキシメチルシトシンの測定を行うこととしたが、新たに可能となったOxidative Bisulfite(OxBS)法の方が、より正確にこれを測定できる可能性が生じた。ヒドロキシメチルシトシンの正確な測定は本研究において極めて重要なため、まずは、凍結保存されたTET酵素をDNA酸化反応に用いるTAB法、及び、金属触媒を酸化反応に用いるOxBS法の両者を詳細に比較検討することとし、実際に、OxBS法の方が安定して確度の高い反応が起きる事を確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の遂行過程にて、TAB-chip法によるヒドロキシメチルシトシンの測定よりも、Oxidative Bisulfite(OxBS)法の方が、正確にこれを測定できる可能性が明らかとなり、その検証実験に時間を費やしたため、実際の研究開始に遅延が生じた。
また、このDNAの酸化に金属触媒（ルテニウム）を用いるOxBS法は、酵素を用いるTAB法に比較し安定した反応系であり、今後の研究にはこの方法を採用することとしたが、その反応に伴うDNA損耗が非常に大きいという欠点があった。この、50-90%近いDNA損耗が発生すると、現有の脳腫瘍DNAサンプル量ではメチル化アレイ解析に足りるDNA量を確保できないことが判明した。この問題に関し、OxBS kitのメーカー側からの技術的アドバイスを受けつつ、DNA beads洗浄工程の見直し等を施行した。これらに加え、DNA beads回収過程で溶液中に水流を発生させ、beadsを中心に集めるなどの独自の工夫を実施した結果、最終的にDNA損耗率を50%以下に抑える事ができ、アレイによる解析を行う事ができるようになったが、これらの条件検討に時間を要した。
このようにしてDNA損耗率を最大限低下させたが、それでもなお、OxBS法を用いてメチル化アレイの解析を行う場合、金属触媒を用いた酸化処理過程でのDNA損耗率が高いことにより、1回の解析あたり1,5-2ugのDNAが必要であった。当研究チームには脳腫瘍検体のDNAはその都度抽出・保管されているが、OxBS法にて解析可能なほど、潤沢な解析用DNAを確保できる症例が少なかった。共同研究施設からの追加検体等も解析に加えながら、解析可能な十分数の症例確保が必要となったため、実際の検体解析開始までに時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで検証を行ってきた、OxBS法を用いた5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）解析により、種々のグリオーマのエピゲノム異常に起因する腫瘍発生・進展機構の解明を目指す。
我々の先行研究の結果からは、神経膠腫の悪性転化に伴う脱メチル化は、ほとんどの脱メチル化領域において、悪性化などの結果で細胞分裂速度が上昇したことによる、受動的脱メチル化であると考えられた。一方で、脱メチル化が起きた領域の中でも、悪性転化に伴い5hmCの増加が見られる遺伝子領域では、そこでTETが働くことで能動的脱メチル化が起きる事も示唆された。能動的脱メチル化が起きた領域では、それにより遺伝子の発現に変化が起きる可能性も高く、悪性転化の原因である可能性がある。そこで、悪性転化に伴い能動的脱メチル化が起きる遺伝子領域を同定する事が、悪性化機序解明において重要であると考える。そこで、まずはIDH変異を有する神経膠腫の悪性転化機構解明に焦点をあて、悪性転化による再発の前後で摘出手術が実施された患者の、解析可能DNAサンプルがあるペア検体を用いて5hmCの網羅的解析を行い、悪性転化に伴い能動的脱メチル化が起きやすい領域（acDEM_region）を同定する。同領域が同定されたら、その領域に属する遺伝子のパスウェイ解析を行い、どのような機能を持った遺伝子において、悪性転化に伴う能動的脱メチル化が起きているのかを検討する。続いて、acDEM_regionに対しモチーフ解析を行い、同領域に特異的にリクルートされている転写因子の探索を行う。また解析症例のRNAseqも行い、acDEM_regionに属する遺伝子の、悪性転化に伴う発現変化や、それによる神経膠腫予後悪化への寄与などの解析を行う予定である。段階的に、能動的脱メチル化を受け悪性転化を惹起した可能性のある遺伝子を同定し、細胞を使った実証実験を行う予定である。
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[Journal Article] Genome-wide DNA methylation profiling identifies primary central nervous system lymphoma as a distinct entity different from systemic diffuse large B-cell lymphoma2017
Author(s)
Nakamura T, Yamashita S, Fukumura K, Tanaka K, Tamura K, Tateishi K, Kinoshita M, Fukushima S,Takami H, Fukuoka K, Yamazaki K, Matsushita Y, Ohno M, Miyakita Y, Shibui S, Kubo A, Shuto T, Kocialkowski S, Yamanaka S, Mukasa A, et al.
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Journal Title
Acta Neuropathologica
Volume: 133
Pages: 321～324
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Distinct molecular profile of diffuse cerebellar gliomas2017
Author(s)
Nomura M, Mukasa A, Nagae G, Yamamoto S, Tatsuno K, Ueda H, Fukuda S, Umeda T, Suzuki T, Otani R, Kobayashi K, Maruyama T, Tanaka S, Takayanagi S, Nejo T, Takahashi S, Ichimura K, Nakamura T, Muragaki Y, Narita Y, Nagane M, Ueki K, Nishikawa R, Shibahara J, Aburatani H, Saito N
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Journal Title
Acta Neuropathologica
Volume: 134
Pages: 941～956
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Genetic and epigenetic stability of oligodendrogliomas at recurrence2017
Author(s)
Akitake Mukasa, Koki Aihara, Masashi Nomura, Shota Tanaka, Junji Shibahara, Yoshitaka Narita, Motoo Nagane, Ryo Nishikawa, Keisuke Ueki, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
Organizer
The 14th Meeting of the Asian Society for Neuro-Oncology
Int'l Joint Research
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[Presentation] Characteristic molecular profile changes in primary and recurrent gliomas depending on their histopathology2017
Author(s)
Akitake Mukasa, Masashi Nomura, Kuniaki Saito, Koki Aihara, Genta Nagae, Takahide Nejo, Shota Tanaka, Shunsaku Takayanagi, Satoshi Takahashi, Mayu Omata, Taishi Nakamura, Yoshitaka Narita, Yoshihiro Muragaki, Motoo Nagane, Keisuke Ueki, Ryo Nishikawa, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
Organizer
22nd Annual Meeting of the Society of Neuro-Oncology
Int'l Joint Research
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[Presentation] Integrated and comparative multi-omics analysis of primary and recurrent glioma and its clinical application2017
Author(s)
Akitake Mukasa, Masashi Nomura, Kuniaki Saito, Koki Aihara, Genta Nagae, Takahide Nejo, Shunsaku Takayanagi, Shota Tanaka, Taishi Nakamura, Yoshitaka Narita, Yoshihiro Muragaki, Motoo Nagane, Keisuke Ueki, Ryo Nishikawa, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
Organizer
第76回日本脳神経外科学会
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