2018 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of Cynomologus Monkey Model for Hereditary Retinal Diseases : Diseases Mechanisms and Therapeutic
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17H06276
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| Research Institution | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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Principal Investigator |
岩田 岳 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 部長 (90374157)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
溝田 淳 帝京大学, 医学部, 教授 (10239262)
下澤 律浩 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 霊長類医科学研究センター, 主任研究員 (50300786)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 医歯薬学 / 外科系臨床医学 / 眼科学 / 眼生化学・分子生物学 / ドルーゼン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトは情報の約8割を視覚情報に頼っており、これが障害されると通常の生活に著しい影響を及ぼす。日本人の主な失明原因である緑内障、加齢黄斑変性、一部の遺伝性網膜疾患はヒトを含む高等霊長類にのみ存在する眼球部位で発症しており、通常使われる実験動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタなど）ではより厳密な疾患モデル動物を作製することは困難である。また、多くの眼疾患はゲノム配列と強く相関しており、原因遺伝子や感受性遺伝子は眼疾患のリスク因子として作用する。眼疾患と関連するゲノム配列を高等霊長類で再現することが可能になれば、ヒトの眼疾患を再現し、病態の解明や治療法の開発に必要な動物モデルとして利用できる。本研究は最新のCRISPR/Cas9遺伝子改変技術をヒトと眼球構造がきわめて類似するカニクイザルに応用し、ヒトの難治性眼疾患を再現して、病態の解明や治療法の開発に利用することを目的とする。緑内障、加齢黄斑変性、遺伝性網膜疾患に関わる遺伝子のノックインカニクイザルの作製をめざす。この研究によって、より患者の病態に近い眼疾患モデル動物の作製が期待され、これまでのマウスを中心とした遺伝子解析動物よりも精度の高い情報が得られると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
カニクイザルモデルに対してGnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法により成熟卵の採取を行ったところ、成熟卵採取において効果的に採取できたり、あるいはできなかったことがあった。カニクイザルではマウスの系統とは異なり、遺伝的背景が揃っていないことや個体の年齢や状態も個々に異なることによって、適した採卵方法ではない可能性が示唆された。また、採卵個体の体重変化において、GnRH agonist投与開始から採卵時までのおよそ一ヶ月の間に、顕著な減少が見られ、本採卵方法による個体の健康状態への影響が考えられた。一方、GnRH antagonistを利用したホルモン投与方法では、GnRH agonistを用いた場合よりも投与から採卵までの期間の短縮および体重減少がほとんど見られないことから、より効率的な卵採取が可能と考えられた。卵数が十分に準備でき、その質に問題がないと確認されたときに顕微授精によって受精卵の作成を行った。その結果作出された前核期受精卵の細胞質中に黄斑ジストロフィの病因遺伝子（A遺伝子とする）あるいは網膜色素変性の病因遺伝子（B遺伝子とする）を改変するように設計されたCRISPR/CAS9タンパク質あるいはmRNAおよびgRNAを同時に微量注入した。注入された前核期受精卵を体外培養後、正常に分割した質の良いと考えられる受精卵を仮腹となる雌カニクイザルへ胚移植を行った。胚移植後約１ヶ月に超音波画像診断により妊娠を確認した。また、一部の注入胚においては、体外培養の継続後、胚盤胞への発生が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度よりCas9のmRNAとタンパク質の両方で個々に胚注入を行ってきたが、タンパク質は凍結できないために、gRNAなどと別途注入が必要であった。マウスとは異なり、カニクイザルでは受精卵を数百単位で準備することは困難であり、今後はCas9 mRNAを中心にgRNAと混合物を適当濃度に調整して、注入受精卵数を増加させたい。妊娠中の胎児おいて遺伝子改変が行われているか否かを確認するために、妊娠中に羊水を採取し、ここからゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子が改変されているか否かを確認したものの遺伝子検査をPCR、PCR産物のTAクローニング、およびDNAシークエンスによって実施した。出産時においても胎児由来産物（血液や胎盤など）をサンプルとした遺伝子検査を行い、羊水DNAサンプルとの一致を確認した。残念ながらゲノム編集後に複数個体が生まれているが、目的とする遺伝子改変カニクイザルは作製されていない。作製されれば、哺育および生育状況を見ながら対象個体の眼底観察を実施する。また、成熟卵を採取する方法としてGnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法に加え、GnRH antagonistを用いた方法あるいはhCG投与から採卵までの時間について卵採取法を行い、受精卵作成の効果や採卵個体への影響について検討する。A遺伝子およびB遺伝子の改変を平行して実施し、CRISPR/CAS9注入胚の胚移植を実施するとともに、胚移植を行わなかった胚において、遺伝子改変の有無を解析する。また一部の胚においては、発生した胚盤胞から内部細胞塊を摘出し、ES細胞の樹立を計る。
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[Journal Article] Novel biallelic loss-of-function KCNV2 variants in cone dystrophy with supernormal rod responses.2019
Author(s)
Kutsuma T, Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K, Iejima D, Gekka T, Kohzaki K, Mizobuchi K, Baba Y, Terauchi R, Matsuura T, Ueno S, Iwata T, Nakano T.
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Journal Title
Doc Ophthalmol.
Volume: 138(3)
Pages: 229-239
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] High-Resolution Retinal Imaging Reveals Preserved Cone Photoreceptor Density and Choroidal Thickness in Female Carriers of Choroideremia.2019
Author(s)
Suzuki K, Gocho K, Akeo K, Kikuchi S, Kubota D, Katagiri S, Fujinami K, Tsunoda K, Iwata T, Yamaki K, Igarashi T, Nakano T, Takahashi H, Hayashi T, Kameya S.
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Journal Title
Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina.
Volume: 50(2)
Pages: 76-85
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Novel mutations in the RS1 gene in Japanese patients with X-linked congenital retinoschisis.2019
Author(s)
Kondo H, Oku K, Katagiri S, Hayashi T, Nakano T, Iwata A, Kuniyoshi K, Kusaka S, Hiyoshi A, Uchio E, Kondo M, Oishi N, Kameya S, Mizota A, Naoi N, Ueno S, Terasaki H, Morimoto T, Iwaki M, Yoshitake K, Iejima D, Fujinami K, Tsunoda K, Shinoda K, Iwata T.
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Journal Title
Hum Genome Var.
Volume: 6
Pages: 3; 1-6
DOI
Open Access
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[Journal Article] Compound heterozygous splice site variants in the SCLT1 gene highlight an additional candidate locus for Senior-Loken syndrome.2018
Author(s)
Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K, Murai N, Matsui Z, Kubo H, Satoh H, Matsufuji S, Takamura T, Yokoo T, Omori Y, Furukawa T, Iwata T, Nakano T.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 8
Pages: 16733
Peer Reviewed
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[Journal Article] KUS121, an ATP regulator, mitigates chorioretinal pathologies in animal models of age-related macular degeneration.2018
Author(s)
Muraoka Y, Iida Y, Ikeda HO, Iwai S, Hata M, Iwata T, Nakayama M, Shimozawa N, Katakai Y, Kakizuka A, Yoshimura N, Tsujikawa A.
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Journal Title
Heliyon.
Volume: 4(5)
Pages: e00624
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Effect of Timolol on Optineurin Aggregation in Transformed Induced Pluripotent Stem Cells Derived From Patient With Familial Glaucoma.2018
Author(s)
Inagaki S, Kawase K, Funato M, Seki J, Kawase C, Ohuchi K, Kameyama T, Ando S, Sato A, Morozumi W, Nakamura S, Shimazawa M, Iejima D, Iwata T, Yamamoto T, Kaneko H, Hara H.
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Journal Title
Invest Ophthalmol Vis Sci.
Volume: 59(6)
Pages: 2293-2304
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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