2019 Fiscal Year Annual Research Report
生理活性化合物の新規標的タンパク質同定法の開発と植物シグナル伝達物質受容体の解明
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17J03994
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
穴吹 友亮 北海道大学, 農学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 標的タンパク質 / 蛍光基 / アフィニティークロマトグラフィー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生理活性化合物の標的タンパク質同定のためには、標的タンパク質を精製し、アミノ酸配列解析に供することが重要である。ビオチンなどの検出基で修飾した生理活性化合物を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる標的タンパク質の精製は多くの研究例がある。しかし、本方法では非特異的に吸着されたタンパク質の混入や回収率の低さという問題があり、標的タンパク質のアミノ酸配列解析を妨げる要因となっている。そのため、この問題を解決した手法を開発できれば、正確でより簡便な標的タンパク質同定が可能になる。そこで、本研究では純度が低いサンプルにおいても標的タンパク質の正確なアミノ酸配列解析を可能にするという観点から、蛍光基を利用した新規な標的タンパク質同定法の開発を研究テーマとした。本手法では、生理活性化合物の化学修飾を最小限に止めたアジドプローブおよびリンカーを用いて蛍光基を標的タンパク質に導入する。当該年度は、これまでに合成した蛍光基を有するリンカーを用いて、新規手法の有効性の検証実験を行った。有効性の検証においては、アブシジン酸（ABA）とその受容体AtPYL2の既知の相互作用を対象とした。組換えAtPYL2を過剰発現した大腸菌由来の粗タンパク質抽出液とABA由来のアジドプローブをインキュベートした。次に、蛍光基を有するリンカーとヨウ化銅を添加し、クリック反応によりアジドプローブに結合させた。360 nmのUVを照射し、標的タンパク質とリンカーのクロスリンクを行った。蛍光基がAtPYL2に導入していることを確認するため、反応後の粗タンパク質抽出液を電気泳動に供した後、ゲル撮影装置を用いて蛍光の検出を試みた。しかし、組換えAtPYL2の分子量付近に蛍光は検出されなかった。本年度内にその原因を特定することはできなかったため、今後手法が有効になるように改良していく必要がある。
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| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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